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PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，
通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。
由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。
Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；
（二）基本要素
1 Taq DNA聚合酶：
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’→3’DNA聚合酶活性；
②无3’→5’外切酶活性，
35轮0.25%错配，与原始模板有差别；
最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸
半衰期：92.5℃ 130min
95℃ 40min
97.5℃5—6min
变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性
pfu DNA 聚合酶
耐热
5’→3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
精确度：pfu >Taq
但pfu扩增效率通常比Taq酶略差
文献报道：Taq pfu 会起到较好效果
（2）Primer 本身不要出现内部互补序列
形成loop环，内部二级结构
如： GGGTCGATTCCTACCCATGC
（3）注意减少Primer间互补序列
导致2个Primer形成dimer
一般不要超过3个互补bp
（4）Primer 5’未端可修饰、突变:
修饰
如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果
突变：
AGCTCCATGACCCAG
5’CGCTCCATGACCCAG 3’
注意：绝不可以在3’端进行上述改造
∵DNA聚合酶是5’→3’聚合，若3’端改造→不能互补→不能延伸
(5）primer 5’端增加碱基
②ATG起始密码
③TAA、TAG、TGA终止密码
如： 可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。
3.模板：
可选：DNA
mRNA→逆转录→cDNA
DNA包括： 质粒 噬菌体 染色体DNA
较小 较大 ①目的gene是单拷贝
变性较易 变性较难 ②非常大，变性难
模板用量
Plasmid:lng
Chromosome:300-500ng
注意： 防止交叉污染
4.dNTP：
四种脱氧核苷酸，基本原料
终浓度：50mM
注意：不稳定，保5.Mg2
TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2
不同的酶需不同Mg2
Taq：较少，Mg2 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度
pfu：Mg2 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍
外界影响： EDTA鳌合Mg2 ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2 结合， 降低Mg2 有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的 Mg2 浓度 存时间长会失效
6.温度和时间：
（1）变性温度：94-95℃
Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑
（2）退火：温度越高，扩增特异性越好
取决于Tm值：Tm↑退火T↑；
Tm↓退火T↓
若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度
（3）延伸：
£500nt---1min >500nt－－3min
一般：40－60sec
（三）PCR技术的应用
1. 基因检测：
2. 基因克隆化
3. DNA突变
4. DNA序列分析
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