适合初步筛查先用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品
熔解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体
无模板特异性不能分辨主带与杂带，给出的是总信号
不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因
灵敏度低
适合于5000 拷贝以上的基因定量
熔解曲线(Dissociation curve)
只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要
[原始数据]
[导数图谱]
•能否用融解曲线区分点突变或SNP？
•探针能做融解曲线吗？
多重荧光定量
•原理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的探针标记不同的颜色。
•特点一次提取DNA/RNA、一次反应得出多个定量结果信号之间要保证互不干扰
多色荧光技术
荧光定量需要ROX校正和IPC校正
检材和对照可以在同一管中定量
仪器须有多荧光检测能力
荧光染料功能分类
Reporter dye : 6-FAM、VIC、TET、NED
Quencher dye:
TAMRA (TaqMan 探针)
Dark Quencher (MGB 探针)
Reference dye: ROX
-passive internal referencefor signal normalisation
-allows relative (not absolute) fluorescence to be measured
-critical for precision
7000：4色荧光
7900：4色荧光
7300：4色荧光
7500：5色荧光
•5 片激发滤色片、5片发射滤色片
•增加荧光无须硬件变动：多重荧光解析算法软件
•你为什么会想到做多重定量？
•多重定量能达到目的吗？
等位基因鉴定原理
两种探针加入同一管
等位基因鉴定实验分两步
等位基因鉴定实验数据
定量PCR仪光学原理
光学结构简图
AB定量PCR仪大家族
定量PCR仪功能一览
•绝对定量(Absolute Quantification)
–自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分比
•相对定量(Relative Quantification)
•等位基因分型(Allelic Discrimination)
•阴阳性鉴定(Plus/Minus with IPC)
定量PCR仪的性能
实时定量小结
污染机会少：闭管化学
没有后处理：不用杂交、电泳、拍照
操作简单：高度自动化
用途广泛：既能定量又能定性
灵活：既可多点测定，又可单点测定
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