2.3.2 标准曲线2 将10
4 cop的竞争模板分别1×10
3，2×10
3，4×10
3，6×10
3，8×10
3，1×10
4，2×10
4，4×10
4，6×10
4，8×10
4，1×10
5，2×10
5，4×10
5 cop待测模板混合后，分别进行30次PCR扩增，作标准曲线2.
2.3.3 标准曲线3 将10
6 cop的竞争模板分别1×10
5，2×10
5，4×10
5，6×10
5，8×10
5，1×10
6，2×10
6，4×10
6，6×10
6，8×10
6，1×10
7，2×10
7，4×10
7 cop的待测模板混合后，分别进行20次PCR扩增，作标准曲线3.
2.4 临床样品的检测结果 用该定量法对24份HBV感染者的血清进行定量测定，其中12份HBeAg 阳性的血清PCR检测HBV DNA为阳性，HBV DNA在血清中的含量6×107～1×1011/L之间(8×109，6×107，5×1010，4×108，10×1010，5×108，1×1011，7×108，9×108，7×1010,4×109,5×109 cop/L)，平均在2.1×1010/L. 而12份HBeAb阳性血清进行测定时，其中7例血清PCR可检出HBV DNA阳性，HBV DNA在血清中的浓度在2×105～3×108 cop/L(6×106，4×106，2×105，5×105，3×108，7×105，1×106 cop/L). 而其余7份血清PCR检测HBV DNA为阴性.
3 讨论
用竞争性PCR定量的基本条件是靶序列和竞争性序列用相同的引物，并以相同的效率扩增［1］. 在本实验中，我们采用一对引物对待测靶序列和竞争序列同时扩增，竞争序列是在靶序列中央插入40bp人工合成的DNA片段而来的，这样就保证了靶序列与竞争序列有相似性，使扩增效率相接近. 实验证明，我们设计的竞争模板与待测靶序列有相同的扩增效率，即两者开始的比值经扩增后没有改变，这就保证了本定量实验的可行性. 插入40bp序列也足以使扩增后的两种产物能在琼脂糖凝胶上被分离开. 但这段序列又不能太长，以免扩增效率和待测模板不一致. 在实验中为了使两条扩增带不相干扰，PCR扩增一定要保证特异性扩增. 为此该定量方法要求按严格的标本处理方法提模板DNA，同时对不同浓度范围内的模板按不同的循环次数扩增，即20～103 cop/每管的PCR用40次循环扩增；103～105cop/每管的PCR用30次循环扩增，105～107cop/每管的PCR用20次循环，这样不仅可以保证低浓度模板能被扩增出来，同时高浓度模板经扩增不易出现非特异扩增带，这样就有了定量的前提条件.
该方法的理论基础为Ax/Ao=(225Yx)/(265Y0)=［225X(1 e)N］/［265M0(1 e)N］. Ax/Ao为待测模板与竞争模板的扩增产物带荧光强度比；Yx/Yo为待测与竞争模板扩增产物拷贝数之比；225bp为待测模板的长度；265bp为竞争模板的长度；X为待测模板的初始量；Mo为竞争模板初始量；e为扩增效率；n为循环次数. 由于本实验中两种模板扩增效率相同，循环次数相同，上式就变为Ax/Ao=225X/265Mo，取对数后为1g(Ax/Ao)=lgX 1g(225/265Mo). 因此，1gX与1g(Ax/Ao)成线性关系［6］. 但在作分级定量的3个标准曲线时，当靶序列比竞争序列的拷贝数大于10倍以后，标准曲线就渐渐偏离理论值，斜率逐渐增大. 这是由于当待测序列的初始模板量大于竞争序列10倍以上时，经过一定的扩增循环后，待测序列的扩增产物量急剧增大，这些产物所产生的荧光强度已接近或超过了检测系统的饱和限. 因此Ax值增加幅度很微小，直至饱和，此后Ax的测量值不再变化［7］. 而另一方面由于PCR反应体系中各种成分迅速被大量的待测序列及其产物占有，竞争序列的扩增就受到强烈地限制，最终扩增产物下降到A0值接近0. 因此我们看到随着待测序列分子数量增加，标准曲线将迅速上升. 为此我们每一级的定量范围在标准竞争模板量的10±1之间.
在定量测定时，我们采用GQS-960凝胶成像及分析系统，对待测及竞争模板的扩增带进行荧光强度比较，经微机计算出相应的待测模板拷贝数. 该方法仍采用溴化乙锭染色，紫外灯下测定荧光. 因此过去有定性PCR设备的实验室，只需购买一套凝胶荧光强度检测仪就可以开展工作. 该定量法不需象以往竞争PCR定量方法那样，测定一个样品DNA要有一系列稀释的竞争模板来标定，而是只要作3个定量(与102，104，106cop竞争模板混合)反应就可最终定出待测DNA模板的拷贝数. 用该方法分别对12份HBeAg阳性和12份HBeAb阳性血清进行定量分析，结果前12份血清均可检测到HBV DNA，并且血清浓度为6×107～1×1011cop/L. 而后12份只检出7份HBV DNA阳性，其在血清中的含量在2×105～3×108 cop/L之间，还有5份血清用该PCR方法未检出HBV DNA. 以上定量结果与文献报道的相近［3］. 上述结果也说明了为什么用简便的处理血清方法进行PCR扩增时，HBeAb阳性血清大部分往往检测不到HBV DNA的原因. 因为一般抗HBeAb阳性血清中HBV DNA含量较低(在3×108 cop/L以下)，而简便血清处理方法最多只取相当于2μL血清中的HBV DNA作PCR扩增，按上面结果计算只含有0.4～6×102 cop. 因此就有一大部分不能被检测出来.
总之，该方法操作简便，结果准确，可用于临床定量检测各种病原体的DNA.
作者简介：郭晏海，男，1964-12-30生，河南省封丘人，汉族. 1989年西安医科大学本科毕业，1995年西安医科大学硕士，讲师，主要从事肝炎病毒基因诊断研究，发表论文18篇.
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