郭晏海1 任峰玲2 闫小君1 苏成芝1
主题词 乙型肝炎病毒；DNA，病毒/分析；聚合酶链反应
中国图书资料分类号 R512.62
摘 要
目的 利用竞争PCR法建立分级测定HBV DNA含量的定量方法.
方法 设立3个标准竞争模板(102cop, 104 cop, 106cop)，分别和恒量的待测模板混合，分别进行40，30，20次循环的PCR扩增，最后凝胶电泳分离待测模板和竞争模板的PCR产物，测定两者的荧光强度的比值，计算待测模板的初始量.
结果 对乙型肝炎血清HBV DNA定量表明，12份HBeAg阳性血清，HBV DNA的血清浓度在6×107～1×1011cop/L，而12份HBeAb阳性血清只有7份可检出HBV DNA，它们的血清浓度均在3×108cop/L以下，其余5份用该PCR方法，检测不到.
结论 该方法可用于HBV DNA以及其他病原体DNA的定量.
Grading quantitative PCR to measure serum HBV DNA levels
GUO Yan-Hai1, REN Feng-Ling2, YAN Xiao-Jun1 and SU Cheng Zhi1
1Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
2Environmental Health Department of Xi'an Medical University, Xi'an 710061, Shaanxi Province, China
Subject headings hepatitis B virus; DNA, viral/analysis; polymerase chain reaction
Abstract
AIM To set up a new method of measuring serum HBV DNA levels with grading quantitative PCR.
METHODS Three standard competition DNA templates (102 cop, 104 cop, 106 cop) were mixed separately with stable sample DNA templates, and then PCR with 40, 30 and 20 cycles was carried out. Then the PCR products of the sample DNA templates were separated from that of the competition DNA complates, and the fluorescence intensity ratio of them were measured. The initial contents of the sample DNA templates were calculated.
RESULTS The serum HBV DNA contents of the 12 samples of HBeAg positive serum ranged from 6×107 to 1×1011cop/L. Only 7 of the 12 HBeAb positive serum could be detected and their HBV DNA were all below 3×108cop/L and the other 5 samples HBV DNA could not be detected with PCR.
CONCLUSION This method can be used to measure the HBV DNA and other pathogenic DNA.
0引言
PCR技术对基因从定性到定量的测定是分子生物学方法研究一大飞跃，定量PCR已成为目前分子生物学技术研究的热点之一. 迄今研究和应用的定量PCR方法有4种，即PCR产物的直接定量；极限稀释法；靶基因与参照基因的同步扩增；竞争性PCR法. 以上方法各有利弊，选择某一方法取决于靶基因的特性，对准确度的要求，需要相对还是绝对的定量. 其中竞争性PCR方法的定量比较准确，被较多地采用［1］. 但该方法在实际应用时，需将恒量的样品DNA与一系列稀释的各种浓度的竞争性模板混合后进行PCR扩增，最后进行电泳，找出待测模板与竞争性模板终产物有相等摩尔数的一个反应，从而确定待测模板的初始量. 因此，对一个样品定量时需要进行多个反应，不适应多样品的同时定量测定. 我们建立了分级定量方法，只用3种浓度的竞争模板与恒定量样品DNA进行3个PCR反应，通过测定待测模板与竞争模板的终产物荧光强度比值，来确定待测样品DNA的初始模板量. 该方法适合多样品同时测定.
1 材料和方法
1.1 材料 GQS-960凝胶成像分析系统(第四军医大学基因诊断技术应用研究所)，Thermolyne PCR扩增仪(美国),Taq DNA聚合酶，dNTP (Promega公司). 引物出自HBV DNA的X区，经oligo软件设计. 引物位置和序列为：B1(1402-1421)，5,-ATC CTGCGCGGGACGTCCTT3；B2(1626-1607)5,-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3扩增比较为225bp，由上海深工生物工程公司合成.
1.2 方法 含靶序列的PUC 19质粒和竞争序列的PUC19质粒，将B1，B2引物扩增HBV DNA的产物克隆入PUC19，该质粒作模拟靶序列用；竞争模板是在正常的B1，B2引物扩增产物中央部插入一段人工合成的40bp的DNA片段，并克隆于PUC19，该质粒作定量实验的竞争模板. 血清处理，主要按酚/氯仿抽提，乙醇沉淀的方法
［2］提取血清中HBV DNA，血清用量为300μL，最后所得HBV DNA等分3份作定量PCR扩增. PCR扩增取上述纯化的HBV DNA(各5μL)分别加入三个定量反应管中，其中的竞争模板量分别为10
2cop,10
4cop,10
6cop. PCR反应成分为50mmol/L KCl，100mmol/LTris-HCl pH 8.3，1.5mmol/L MgCl
2， 200μmol/L dNTP，B1，B2引物各30pmol. Taq DNA聚合酶1U，反应总体积30μL. 反应程序为：94℃预变性2min，然后94℃ 30s，55℃ 40s, 72℃ 50s分别循环40次，30次，20次后，72℃延伸5min，最后各准确取10μL PCR反应产物，进行40g/L琼脂糖凝胶电泳
［3］. 荧光强度测定：将用溴化乙锭染色的凝胶板置于GQS-960型凝胶呈像分析系统上进行扫描，测定荧光强度比值
［4，5］，并用微机计算结果.
2 结果
2.1 竞争模板与待测模板扩增效率比较 对3个待测模板与竞争模板的PCR产物荧光强度比分别为10∶1；1∶1；1∶10的反应液进行106倍稀释，再各取3μL稀释后溶液进行PCR扩增，循环30次，结果两者荧光强度之比仍为10∶1；1∶1；1∶10. 说明所用引物对待测模板与竞争模板的扩增效率相等.
2.2 引物对两种模板的检测灵敏度 将提取并纯化的含有两种模板的两种质粒定量后，按2×105，2×104，2×103，2×102，20 cop分别进行PCR扩增反应，扩增40次循环，结果两种模板都被检测到20 cop的模板量.
2.3 标准曲线
2.3.1 标准曲线1 将102 cop的竞争模板分别与20，40，60，80，100，200，400，600，800，1000，2000，4000 cop的待测模板(含靶序列的PUC19质粒)混合后进行40次PCR扩增. 测定待测模板与竞争模板的PCR产物荧光强度之比(Ax/Ao)，并以1g(Ax/Ao)作纵坐标，以待测模板初始量的对数lgX为横坐标作标准曲线1(以下作法相同).
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