| 王 泓1 , 江咏梅1 , 曹桂群2 , 夏庆杰2 , 杨 惠1 ,
蒋 敏1 , 贾文祥3 , 陈 岚1 , 周 伟1 , 李文胜1 ,
(1. 四川大学华西第二医院, 四川成都610041 ; 2. 四川大学华西医院, 四川成都610041 ;
3. 四川大学华西基础医学与法医学院, 四川成都610041)
摘要: 目的 建立一种多重PCR 方法,在同一扩增体系内同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因,
探讨采用多重PCR 同时检测淋菌及其耐药基因的可行性。方法 根据淋菌CPPB、TeM21、Tet2M基因序列,分别设计了3 对引物,并在同一扩增体系内行PCR 扩增,扩增的靶序列分别为150 bp 、224 bp 、316 bp 。结果 淋菌及其青霉素、四环素耐药的标准菌株,上述3 个基因位点的检测均为阳性,对125 例临床标本同时进行传统培养、药敏和多重PCR 检测,结果显示淋菌的检出率:培养法为20. 0 % ,PCR 法为24. 8 %;PPNG检出率:药敏法为16. 0 % ,PCR法为20. 8 ;TRNG检出率:药敏法为14. 4 % ,PCR 法为19. 2 %。结论 该法与传统的培养及药敏试验相比具敏感、特异、迅速、标本不受淋菌存活以及药敏试验诸多因素的影响,是一种简便、快速、可靠的方法。
关键词: PCR; 淋病奈瑟球菌; 耐药基因
中图分类号: R759. 2 文献标识码: A 文章编号: 100524529 (2005) 0120023203
自20 世纪80 年代以来,淋病已成为我国发病率较高的性传播疾病,而淋病奈瑟球菌(简称淋菌)的耐药性日益增多,给淋病治疗带来新的问题。淋菌对抗生素的耐药性可由质粒、染色体或二者共同介导1 。自1976 年和1985 年美国等先后分离出耐青霉素淋菌(PPNG) 和高度耐四环素淋菌(TRNG) 以来,许多国家都有大量文献报道淋菌及耐药性问题。虽然青霉素和四环素不再作为治疗淋病首选药物,但PPNG、TRNG的检测仍是淋菌耐药性流行病学监测中的重要指标之一,传统的方法主要靠培养鉴定及药敏试验,步骤复杂,周期长,易受标本采集、运输、保存以及患者病情、治疗情况等因素影响,不利于PPNG、TRNG株的快速检出和淋病的早期诊断和治疗。1994 年,Ogunrinu 报道了用两对引物在同一扩增体系内同时检测淋菌和耐青霉素基因,郭露等2 建立了淋菌TRNG 株的PCR 检测方法,陈斌等3 采用两对引物套式PCR 检测PPNG,我们在此基础上进行了进一步探讨,即用3 对引物在同一扩增体系内同时检测淋菌及耐青霉素基因(TeM21) 、耐四环素基因(Tet2M) ,并与传统培养和药敏法进行比较,为临床早期快速检测淋菌及其耐药性研究提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株来源 临床分离与鉴定的淋菌双重耐药菌株由四川大学华西医院皮肤科性病实验室和我院性病门诊患者泌尿生殖道分泌物中分离得到,标准菌株A、B、C 由四川省皮肤病研究所提供。
1. 1. 2 培养基和药敏 淋菌培养基为广州乐通泰公司提供,青霉素及四环素药敏纸片为法国生物梅里埃公司提供。
1. 1. 3 PCR 试剂 由成都进取公司提供,引物由北京赛百盛公司合成,PCR 扩增仪为美国PE 公司的PE9600 ,3 对引物设计分别为:
第1 对引物:
淋菌CPPB 基因,扩增产物150 bp ,
5′-CATTGCCCAACGTGCCGACCT-3′
5′-GAGACTTTGACCCGACAGAAGAC-3′
第2 对引物:
TeM21 基因,扩增产物224 bp ,耐青霉素
5′-GATGCTGAAGATCAGTTGGGT-3′
5′- GTGACTGGTGAGTACTCAAA-3′
第3 对引物:
Tet2M基因,扩增产物316 bp ,耐四环素
5′-GGATTGATAACCTTATAGAAGT-3′
5′- TTTGTATCTCCAAGAACACTAT-3′
1. 2 方法
1. 2. 1 淋菌培养及药敏 淋菌通过培养、革兰染色、氧化酶试验和糖发酵试验确定;用琼脂稀释法进行青霉素及四环素药敏试验,测定MIC。
1. 2. 2 DNA 模板的提取制备 将分泌物接种于淋菌培养基上,放CO2 孵箱37 ℃培养24～48 h ,取2～3 个菌落于50μl 蒸馏水中,100 ℃15 min 加热裂解,13 000 r/ min低温离心15 min ,取上清液备用。
1.2. 3 PCR 扩增 在微量离心管中依次加入10 ×PCR缓冲液3μl (含MgCl2 1. 5 mmol/ L) ,引物各10 pmol , 10 mM dNTP 0. 25 μl , Taq DNA 聚合酶1. 5 U ,模板DNA 2 μl ,蒸馏水至30 μl ,反应条件,94 ℃预变性2 min ,再94 ℃30 s ,50 ℃60 s ,72 ℃60 s ,35个循环后,72 ℃延伸5 min。
1. 2. 4 扩增产物的检测 将扩增产物点样于2 %琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0. 5 mg/ L) , 100 V 电泳20 min后,紫外透射仪观察结果并进行凝胶照像。
2 结 果
2. 1 淋菌分离株PCR 扩增结果 经淋菌培养鉴定的阳性菌株20 例, 进行PCR 扩增后, 在150 bp(20/ 20 ,CPPB 扩增产物) 、224 bp (10/ 20 ,TeM21 扩增产物) 、316 bp (8/ 20 ,Tet2M 扩增产物) 各有一条带出现,结果见图1。
图1 淋菌标准株、分离株PCR 电泳结果
注:1 阴性对照,2、3 淋菌阳性菌株,4、5 淋菌阳性同时耐青霉素菌株,6、7、8 淋菌阳性既耐青霉素又耐四环素菌株,9 标志物:分子量为150 bp 、224 bp 、316 bp ,10、11、12 淋菌标准菌株A、B、C。
2. 2 淋菌标准菌株及其他细菌扩增结果 分别将淋菌标准菌株A、B、C 进行PCR 扩增,在150 bp 均有淋菌CPPB 基因特异性条带(图1) ,将我科微生物室分离培养的20 株大肠埃希菌、痢疾志贺菌耐青霉素、四环素菌株用上述相同方法行PCR 扩增, 在150 bp 、224 bp 、316 bp 处均无特异性条带出现。
2. 3 临床标本培养及PCR 测定结果 取泌尿生殖道标本125 例同时进行培养、药敏和PCR ,其结果见表1 : PCR 法与培养法及PPNG、TRNG 药敏试验比较,结果显示淋菌的检出率:培养法为20 % ,PCR 法为24. 8 %;PPNG检出率:药敏法为16. 0 % ,PCR 法为20. 8 ;TRNG检出率:药敏法为14. 4 % ,PCR 法为19. 2 %。
3 讨 论
传统的淋菌培养鉴定及药敏试验至少需48～72 h ,周期长、步骤复杂,而且受标本采集、运送、培养阳性率低等影响,此外,药敏试验还受培养基、抗生素纸片、细菌接种量及细菌存活等因素影响,导致药敏判断误差。而PCR 法具敏感、特异、迅速、标本不受淋菌存活的影响等优点,已在临床广泛应用。目前,国内有报道用多重PCR2核酸探针杂交技术、荧光定量聚合酶链法同时检测淋菌、解脲脲支原体、沙眼衣原体等多种病原体4 ,5 ,也有用PCR 方法检测淋菌或青霉素、四环素耐药性的报道,其所采用的PCR 技术一般都为单对引物,不同扩增体系,尚无在同一扩增体系内同时检测淋菌及青霉素、四环素耐药基因的报道。我们根据淋菌CPPB 基因、耐青霉素的TeM21 基因、耐四环素的Tet2M 基因分别设计了3对引物在同一扩增体系内扩增,根据扩增的条带即
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