PCR技术

1 导论
多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美国Perkin-Elmer/Cetus公司人类遗传研究室Mullis K. B.等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术，是八十年代分子生物学资源领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。该技术一问世，就在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等领域得到快速而广泛的应用，并且对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展也起了巨大的推动作用。
PCR技术是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术（亦称无细胞分子克隆技术）。它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增。其过程包括模板变性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在内的重复循环系列，使末端被引物5’端限定的特异性片段成指数形式累积。由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长。因此20次PCR循环将产生约一百万倍（220）的扩增产物，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点，并且具有从DNA粗制品和降解的DNA模板中扩增靶序列的能力，这一点在生药鉴定应用中尤为重要。
PCR的原理类似于DNA的天然复制过程，关键是运用两个起始引物，分别为待扩增序列的相对的两条单链DNA结合，结合位点分别位于待扩增序列的两端，并且3’端相对，然后利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制，在两个引物之间诱发聚合酶反应。PCR反应可以简述如下：
在微量离心管中加入适量缓冲液，加微量模板DNA，四种脱氧单核苷酸（dNTP），耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg² 存在。
1、加热使模板DNA在高温下（95℃左右）变性，双链DNA解开而变成单链DNA游离于溶液中。这是所谓变性阶段。
2、PCR的引物是两段人工合成的寡核苷酸链，长度为16－24个核苷酸残基，其顺序由被扩增的DNA片段两端的序列决定。这两段寡核苷酸链分别与模板DNA的正链和负链互补，所互补的位点一个在被扩增序列的“上游”，一个在被扩增序列的“下游”。高温使模板DNA变性成单链以后，温度降低，由于PCR反应体系中引物的拷贝数远远多于模板DNA的拷贝数，因而引物与模板DNA形成复合物的机率要大大高于模板DNA两条单链的重新结合。只要严格地控制复性的条件，复性过程是倾向于形成引物与模板的复合物的。这是退火阶段。
3、溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。这是延伸阶段。
如此重复，改变反应温度，即高温变性，低温退火，中温延伸三个阶段。这三次改变温度为一个循环。每循环一次，使特异区段基因拷贝数扩大一倍，一般30次循环，基因放大数可达2ⁿ倍。可用公式
Y＝（1＋X）ⁿ
表示，式中Y＝DNA扩增倍数，X＝扩增效率，循环数为n。
如X＝100%，n＝20时，Y＝1048576倍。但实际扩增效率（X）不会达到100%。

2 试验条件
本程序适用于自动PCR操作，可适用于大多数情况，所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶，如Taq聚合酶等。

【药品试剂】
引物（各50pmol）
0.2mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）
模板DNA：约0.05～1mg基因组DNA或0.002～0.02mg质粒DNA
Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）
10×PCR缓冲液（500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl₂，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3）
矿物油
电泳所需试剂

【仪器设备】

PCR扩增仪
电泳装置
微量离心机
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5ml Eppendorf管
紫外线观察装置及照相设备

2.2.2.3 操作程序

1．在无菌的Eppendorf管内加入以下反应物：


2．93℃反应2 min后开始以下循环：
93℃变性反应1 min；
50℃退火反应1 min；
72℃延伸反应3 min。
经过17～35循环后，最后一个循环72℃增加5 min。循环结束后反应产物置于40℃保存。
3．取1～5ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。

2.2.2.4 应注意的问题及其解决方法
1．PCR反应条件的优化
要优化特定的PCR反应，有必要试用不同的反应组分和循环参数。表2-1列出了添加或改变某一试剂浓度对反应结果的影响，从中大家可以得到一些线索以改进反应条件，提高PCR产量和/或特异性，一般情况下，只须改变一两个参数就行了，如pH值和MgCl₂浓度。表2-2给出了循环参数对PCR结果的影响。
表2-1 PCR各反应组分浓度对产物特异性和产量的影响

反应组分	提高产量	提高特异性
模板浓度	增加	减少
引物浓度	高至75 pmol	低至15 pmol
引物长度	－	增加
dNTPs	各1 mmol/L	各20 mmol/L
Tris-HCl (10 mmol/L pH8)	pH高至10*	pH高至10*
MgCl2	高至4 mmol/L	1.5 mmol/L
DMSO	－	10%**
甘油	－	2%
甲酰胺	－	5%
Taq DNA聚合酶***	高至5U	0.5U