PCR操作范例及反应体系的组成

　　扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30个循环。

　　注：[1]反应缓冲液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

　　15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl₂,

　　0.01%(W/V)明胶（Sigma G2500）

　　[2]酶储存缓冲液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,

　　20mmol/L Tris-HCl ph8.0

　　0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

　　200μg/ml明胶

　　0.5%吐温20，0.5% Nonidet P40

　　[3][4]引物，1，2：扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段

　　引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

　　引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

　　注意（3’）端有2个bp互补故易生成50bp的双体

　　二、PCR反应系统的组成

　　（一）PCR缓冲液（PCr Buffer）

　　用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg² 优于Mn² ，而Ca² 无任何作用。

　　1．Mg² 浓度Mg² 的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg² 浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg² 过量易生成非特异性扩增产物，Mg² 不足易使产量降低。

　　样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg² 结合而降低Mg² 有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

　　dNTP含有磷酸根，其浓度变化将影响Mg² 的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs