错配PCR-限制性片段长度多态性分析检测HBV前终止admin888变异株技术

1.4 肝功能检测

采用贝克曼CX-V型全自动生化分析仪。

1.5 主要试剂

Taq DNA聚合酶为华美公司产品，dNTPs为Promega&127;公司产品，&127;限制性内切酶DdeI由Boehringer Mannheim公司提供。

1.6 引物设计

根据HBV前C区变异区核苷酸序列，设计正向错配引物BC₁5’-&127;AAGCTG TGC CTT GGG TGG CCT T-3^，(1874-1895nt)，其中第20个nt由原来的T改为C，以期在前C区第83nt点突变株HBV DNA的PCR扩增产物中引进DdeI酶切点。&127;反向引物为BC₂5’-GGA AAG AAG TCA GAA GGC AA-3’。扩增产物102bp。引物委托上海Sangon公司合成。

1.7 血清HBV DNA抽提

采用裂解液与加热变性相结合的方法。血清50μl加裂解液(异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇)5μl，50℃ 裂解20分钟后96℃变性10分钟，离心取上清10μl做为模板，进行PCR反应。

1.8 PCR反应

在0.5ml反应管加入10×Taq酶buffer 7.5μl、2mmol/L dNTPs&127;7.5μl、Taq酶3U、引物BC₁和BC₂20pmol/L。反应体积75μl。&127;用石蜡油封顶后按下列参数扩增循环：94℃30秒、56℃30秒、72℃45秒，共35个循环。最后延伸7分钟。取PCR产物13μl用3%琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果，出现102bp DNA扩增带者为HBV DNA阳性。

8. 1.9 PCR产物回收

吸取PCR产物60μl加双蒸水100μl，用酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，60℃烤干后沉淀重新溶于17μl双蒸水。

1.10 RFLP分析

在上述含102bpHBV DNA的PCR产物中加入内切酶buffer &127;2μl、DdeI 10U，反应体积20μl。置37℃反应4小时。酶切产物经3%琼脂糖电泳，EB染色后，紫外灯下观察结果，产生82bp DNA带者为前C区83nt位终止密码变异株，否则为野毒株(见图1)。

1.11 序列分析

选择以mpPCR-RFLP法判断的有或无前C区第83nt终止密码变异株的样品各2份，经PCR扩增后，取PCR产物300μl经0.1%低溶点琼脂糖纯化回收，采用双脱氧链末端终止法直接进行前C区序列分析，以验证上述RFLP分析结果。

2 结果

2.1 mpPCR-RFLP结果

HBV前C区终止密码变异株与野毒株感染者血清PCR产物电泳均可见102bp的DNA带，与预期大小相符。&127;PCR&127;产物经DdeI&127;酶切后在变异株则出现82bp的DNA带，而野毒株DNA带大小仍为102bp。

2 .2 测序结果

对经mpPCR-RFLP鉴定的突变株与野毒株标本的PCR产物的测序结果，经计算机分析均为HBV前区特异性序列，但在变异株的第83位nt,由G变为A，而野毒株仍为G。

2.3 对照试验结果

对60份血清标本分别用常规PCR(C区引物)法与mpPCR&127;作平行检测，两者检测结果符合率达95%。

2.4 敏感性试验结果

对经定量PCR检测的不同HBV DNA含量的阳性血清，采用mpPCR检测，结果显示其检出水平达10⁵拷贝/ml。

2.5

4. 重复性试验结果

   对30份临床标本(前C区变异株15份、野毒株10份、HBV DNA阴性标本5份)由不同人员操作重复测试3次，符合率达100%。

   2.6 临床应用结果

对74份临床血清标本，采用mpPCR进行检测，结果41&127;份阳性，经RFLP分析其中有17份为HBV前C区变异株(41.5%)。

3 讨论

乙型肝炎病毒(HBV)是高度变异的，没有两株病毒核苷酸序列完全相同^[10]。&127;HBV感染有不同的疾病谱，可能与其变异有关。&127;目前国内外研究得最多的一种变异就是导致HBV e抗原消失的前C区点突变，既见于暴发性肝炎^[11]，亦见于慢性无症状携带^[12]；既可引起持久感染，复制水平却又较低^[13]；其对干扰素治疗的敏感性也较差^[14]，停药后易复发。HBeAg既是病毒复制和传染性的标志，又被认为是一种免疫调节因子^[15]，可抑制Tc细胞对受HBV感染的肝细胞的攻击，从而减少对HBV的免疫清除，可见前C区终止密码变异可能与机体免疫状态和疾病的发展密切相关，具有重要的临床意义。

我们根据mpPCR-RFLP原理，参照有关文献^[9]，建立了一种检查HBV&127;前C&127;区第83位终止密码变异株DNA的改良mpPCR-RFLP技术。&127;该法采用裂解与加热变性相结合的方法制备HBV DNA模板，直接用于mpPCR反应。这在国内外尚属首次报道。与常规蛋白酶K消化加酚抽提制备HBV DNA模板相比较，操作极为简单，不易造成交叉污染，所需时间大为缩短，成本明显降低，血清标本用量减少四分之三。为提高本法敏感性，将mpPCR反应体积扩大到75μl，并在RFLP分析前对PCR产物进行纯化浓缩，使酶切反应更加完全彻底，检测敏感性提高。此外，由于DNA产量大，浓度高，本技术采用3%琼脂糖电泳，代替聚丙烯酰胺电泳，使操作过程进一步简化，便于临床推广应用。