转基因花卉的DNA提取与多重PCR分析

1.2.1 基因组DNA的提取
CTAB法：菊花、矮牵牛、非洲菊各取来自不同株的2个样品，每个样品取0.5g新鲜叶片，加液氮研磨，加600μL 1.5×CTAB缓冲液[1.5％CTAB，75mmol/L Tris-HCl（pH8.0），15mmol/L EDTA（pH8.0），1.05mol/L NaCl]，56℃温浴20min，期间不时晃动，加等体积氯仿：异戊醇（24：1），振荡，12,000g离心10min，取上清，加1/10体积的56℃预热的10％CTAB（100mg/mL CTAB，40.95mg/mL NaCl)，加等体积氯仿：异戊醇（24：1），振荡，12,000g离心10min，取上清，加等体积1％CTAB[1％CTAB，50mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）]，颠倒混匀，12,000g离心10min，取沉淀，加400μL 1mol/L NaCl，3μL RNase（20mg/mL），56℃温浴（＞3h），加2倍体积的无水乙醇，12,000g离心10min，取沉淀，70％乙醇清洗2次，干燥，加100μL TE（pH8.0）溶解。
试剂盒提取方法按照Takara宝生物工程有限公司提供的说明书进行。
取5μL DNA经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 普通PCR
10×PCR缓冲液2.5μL，Mg2＋贮存液1.5μL，dNTP 0.5μL，引物终浓度为0.4μmol/L，模板DNA为1μL（10ng），Taq DNA聚合酶1U，ddH2O将体积调整为25μL。CaMV35S启动子、NOS终止子的扩增条件为：94℃，5min，54℃，55Sec，72℃，1min；94℃，30Sec，54℃，50Sec，72℃，30Sec，35个循环；72℃，8min。NPTII的扩增条件为：94℃，5min；94℃，30Sec，50℃，30Sec，72℃，30Sec，35个循环；72℃，10min。取10μL PCR产物，经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR产物的酶切鉴定
CaMV35S启动子PCR产物的酶切反应体系为：10×缓冲液2μL，乙酰化BSA（10μg/μL）0.2μL， DNA 7.5μL，XmnI（10U/μL）0.5μL，ddH2O将体积调整为20μL。NOS终止子PCR产物的酶切反应体系为：10×缓冲液2μL，乙酰化BSA（1mg/mL）2μL，DNA 7.5μL，NsiⅠ（8-20U/μL）0.2μL，ddH2O将体积调整为20μL。混匀后置37℃水浴4hs。酶切产物用3％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 MPCR
分CaMV35启动子＋NOS终止子、CaMV35启动子＋NPTII基因、NOS终止子＋NPTII基因、CaMV35启动子＋NOS终止子 NPTII基因4个组合进行MPCR。35S-1、35S-2、NOS-A、NOS-B的终浓度均为0.4μmol/L，NPTII-1、NPTII-2的终浓度均为1.2μmol/L，Taq DNA聚合酶1U/对引物，其余成分用量同普通PCR。反应条件同CaMV 35S启动子、NOS终止子。反应结束后，取PCR产物10μL经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结 果

2.1 DNA的提取结果

图1 2种方法提取的DNA
1-6. CTAB微量提取法提取的DNA，1-2. 菊花，3-4. 矮牵牛，5-6. 非洲菊；7. 100bp Ladder DNA marker
8-13. DNA提取试剂盒提取的DNA，8-9. 菊花，10-11. 矮牵牛，12-13. 非洲菊；
Fig. 1 The DNA extracted by two methods

图1是采用2种方法提取的3种花卉的基因组DNA的电泳结果，可看出，采用CTAB法提取的DNA电泳结果背景很糊，有拖尾现象，纯度不高。而试剂盒提取的DNA只有一条明显的条带，背景清晰，纯度高。故以试剂盒提取的DNA进行PCR扩增。

2.2 普通PCR检测结果

图2－4是3种花卉6个样品的普通PCR检测结果。CaMV35S启动子、NOS终止子、NPTII基因的PCR产物大小分别为195bp、165bp、600bp。

3对引物扩增的PCR产物中，空白对照无任何可见的条带，而阳性对照pBI121的3对引物的扩增产物均为单一条带，大小与预期的一致，表明本次实验操作和PCR检测条件是可靠的。

3种花卉的6个样品中仅矮牵牛的1个样品有扩增到与阳性对照大小一致的片段，即含有本实验待检测的3种转基因成分，其余为阴性结果。

2.3 PCR产物的酶切鉴定

XmnI内切酶识别的序列为5’-GAANN NNTTC-3’，将CaMV35S启动子的PCR产物切成大小为115bp和80bp的2个片段。NsiI内切酶识别的序列为5’-A TGCA T-3’，将NOS终止子的PCR产物切成大小为120bp和45bp的2个片段。由图5可看出，矮牵牛的1个样品、pBI121的CaMV35S启动子、NOS终止子PCR产物分别经XmnI、NsiI酶切，得到的酶切产物均与预期结果一致，表明PCR产物为非假阳性。

2.4 MPCR检测结果

图6是转基因矮牵牛和阳性对照质粒pBI121的二重与三重PCR扩增产物的电泳结果。

空白对照均无明显条带，而第3、4泳道都有2条带，分别是CaMV35S启动子（195bp）与NOS终止子（165bp）的扩增片段；第6、7泳道的2条带分别是CaMV35S启动子与NPTII基因（600bp）的扩增片段；第10、11泳道的两条带分别是NOS终止子与NPTII基因的扩增片段。第13、14泳道都有3条带，从下到上，分别是NOS终止子、CaMV35S启动子与NPTII基因的扩增片段。其中第3、6、10、13泳道的模板DNA是转基因矮牵牛的基因组DNA，第4、7、11、14泳道的模板DNA是阳性对照pBI121质粒DNA。4个组合的MPCR检测结果均得到预期结果，表明建立的MPCR技术应用于多种转基因成分的同时检测是可行的。