转基因花卉的DNA提取与多重PCR分析

邵碧英1，陈文炳1，李寿崧1，李世成2，叶文飚2，陈亮3
（1.福建出入境检验检疫局，福建 福州 350001；2.厦门北大之路生物工程有限公司，福建 厦门 361009； 3. 厦门大学生物系，福建 厦门 361005）

摘要：分别以CTAB法、试剂盒提取菊花、矮牵牛、非洲菊3种花卉的基因组DNA，凝胶电泳结果表明试剂盒提取的效果较好。设计合成了3对引物，分别用于扩增花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因（NOS）终止子、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶II（NPTII）基因。普通PCR检测结果表明，3种花卉6个样品中仅矮牵牛的1个样品含有这3种转基因成分，酶切鉴定结果验证了PCR产物为非假阳性。尝试以多重PCR同时检测转基因矮牵牛与对照阳性质粒中的2个或3个转基因成分，得到预期结果。

关键词：多重PCR；35S启动子；NOS终止子；NPTII基因

中图分类号： S727-31；Q78 文献标识码：A

DNA Extraction and Multiplex Polymerase Chain Reaction Analysis of Transgenic Flowers

SHAO Bi-ying1，CHEN Wen-bing1，LI Shou-song1，LI Shi-cheng2，YE Wen-biao2，CHEN Liang3
（1. Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Fuzhou 350001，China；
2. Xiamen Bioway biology engineering company，Xiamen 361009，China；
3. Dept. of Biol.，Xiamen Univ.，Xiamen 361005，China）

Abstract：The DNAs of chrysanthemum, petunia and Gerbera were extracted by CTAB method and DNA extraction kit, respectively. The gel electrophoresis result showed that the DNA extraction kit is more effective. Three pairs of primes were designed and synthesized to amplify Cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promoter, Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase terminator and Escherichia coli strain K12 neomycin phosphotransferase II gene, respectively. The general PCR detection results suggested that only one sample of petunia contained the three genetically modified ingredients among six samples of the three flowers. The restriction enzyme analysis result suggested the PCR products were not false positive. The multiplex polymerase chain reaction（MPCR）was attempted to detect two or three genetically modified ingredients of transgenic petunia and positive control plasmid at the same time, and obtained the same results as expected.

Key words：multiplex polymerase chain reaction；35S promotor；NOS terminator；NPTII gene

随着基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。2001年全球转基因农作物种植面积已达5260万公顷，我国的转基因作物种植面积也从2000的年50万公顷猛增到2001年的150万公顷，增加3倍[1]。2001年我国从国外进口的转基因农产品如大豆、玉米等在1000万吨以上。根据国务院2001年5月23日发布的《农业转基因生物安全管理条例》，农业部发布并于2002年3月20日起正式实施的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》规定，我国对进口的转基因农产品实施强制性的标识制度，转基因生物及其产品的检测任务将越来越重。因此，研究开发快速、准确、简便经济的转基因检测方法，是摆在我们质检系统转基因产品检测科技工作者面前的重要而紧迫的任务。聚合酶链式反应（PCR）是近年来在质检系统中常用的一种快速、灵敏的转基因产品检测方法，而CaMV35S启动子、NOS终止子和NPTII基因是最常见的检测项目。PCR反应要求待分析的基因组DNA样品尽可能纯化，否则将受到干扰，降低检测的灵敏度和重复性，结果出现假阴性。应用普通PCR检测多个靶位点时，分开加样操作较繁琐。而多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR）是在一个反应体系中加入多对引物同时检测多个靶位点的技术，与普通PCR相比要省时、节约试剂。据检索，多重PCR在病毒检测中应用较多[2-4]，而在转基因成分定性[5]与定量[6]检测中的应用报道还不多。本研究选取3种花卉，比较了2种DNA提取方法，筛选出DNA提取纯度高的方法以用于PCR定性检测它们基因组中的转基因成分，同时尝试了应用多重PCR同时检测多个转基因成分，为转基因生物及其产品的实际检测工作、在福建省内的分布情况的大范围普查打好基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

转基因菊花、矮牵牛、非洲菊的组织培养扩繁后代和阳性对照质粒pBI121由厦门北大之路生物工程有限公司提供。DNA提取试剂盒（DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver.2）购自Takara宝生物工程有限公司（大连）。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl2贮存液、RNase购自上海博亚生物技术有限公司。限制性内切酶XmnⅠ购自Promega公司，NsiⅠ购自华美生物工程公司。100bp ladder DNA Marker购自上海生工生物工程有限公司。引物35S-1：5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’，35S-2：5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’，NOS-A：5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’，NOS-B：5’-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3’，NPTII-1：5’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’，NPTII-2：5’-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方 法