PCR技术与病毒性肝炎检验及病程跟踪

我国病毒性肝炎病人较多，其中以乙型肝炎及丙型肝炎最为突出，十亿人口中约有一亿乙肝病毒携带者，为世界乙肝携带者一半。对于病毒性肝炎感染标志物的检测，随着分子生物学的发展，方法得到不断更新，水平不断提高，越来越接近病原微生物的本质。目前在我国广泛应用的检测方法，称酶免疫测定法（EIA），其原理是检测各种病毒的抗原及相应抗体。酶免法较以前依靠肝功变化等机体代偿性变化生理指标更直接、确实、可靠。

1988年开始，我国相继对乙型、甲型及丙型肝炎体外诊断试剂开展了质控和室间质评，使检验的准确性得到提高。但酶标法由于敏感性不足，操作步骤较多，一步支试剂会出现高浓度饱和，低浓度无法固相化，因而影响了检测质量。因此，目前需要推出一种敏感、特异、易于自动化、便于推广的检测试剂。免疫渗滤试验（DICA）及核酸杂交法是继EIA后较有前途的检测手段。然而DICA法不能直接检测病毒遗传物质，杂交法敏感度又较低，这些都限制了它们的推广。PCR法直接检测病毒基因、敏感、特异且易于自动化，克服了EIA、DICA及杂交法的缺点，是检测技术的一项革命性突破。

PCR（Polymerase Chain Reaction）检测技术，简言之就是在体外利用耐热DNA聚合酶，把样本中的某基因片段进行复制、扩增到一个庞大的数量，从而很容易检测出来。这一方法直接检查病原微生物的遗传物质，所以特异性强是病毒感染的最直接证据。其次，PCR法可以在几个小时内将特异的一段DNA序列扩增到数百万倍以上，因此它具有极高的敏感性。巢式PCR、逆转录PCR（RT-PCR）竞争性定量PCR及PCR联合斑点杂交等技术的出现，大大地提高了PCR检测的敏感性和检测范围，使RNA病毒的检测也得到很大程度上的改进。原位PCR技术对于致病机制的研究有很大的帮助。目前，PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一。

一、PCR与病毒性肝炎的早期诊断引起乙肝病毒（HBV）感染的病毒量极微，据报道接种0.04UL的感染血液就足以导致传染。这样微量病毒进入体内，早期是EIA检测极限以外，一般认为HBSAg的EIA检测法灵敏度为0.1ng，只有病毒在体内繁殖在体内繁殖增生到相应浓度时才能被检出。核酸杂交法较EIA法更直接，敏感度也有所提高，其敏感度可达0.1Pg病毒核酸，即使这样在早期仍然无法检出微量病毒。PCR法的使用，可以将病毒的某段特异性基因扩增数百万倍，因此可以将少到几个病毒的样本检出。特别是巢式PCR的使用使其敏感度又有所增加，当然巢式PCR的要求极高，必须在相当严密的条件下进行，否则其假阳性率将较常规PCR法高得多，建议不要在临床常规检验中使用。

丙肝病毒至今尚未成功分离，丙肝病人血清中病毒含量很低，无法用酶标的方法从血清中检出丙肝抗原。目前，所使用的丙肝酶标诊断试剂盒主要是检测丙肝相应抗体，无法用EIA法检出丙肝，杂交的方法因基敏感性问题在丙肝的早期诊断受到限制。另外，EIA法检测丙肝，所使用的诊断试剂盒包被抗原是合成肽或生物工程蛋白质，这些人工抗原与丙肝的天然结构及免疫原性有一定差别，易造成漏检。而RT-肝炎病人中24例检HBV DNA。Liang也报道应用PCR法检测HBSAg阴性肝炎病人，其HBV DNA检出率在30％左右，其次是对慢性PCR的方法就可以避免这些缺点，先在逆转录酶的作用下，将丙肝病毒的某段序列逆转录为cDNA，一般都选择在5′端非编码区，再利用PCR原理，对cDNA进行扩增，赖PCR的高敏感性，可以早期诊断HCV的感染。

二、PCR的高敏感性提高对肝炎病人诊断的准确性。