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基因的PCR扩增（聚合酶链式反应）

点击： 作者： 来源： 时间： 1970-01-01 　本站论坛

²浓度直接影响到DNA扩增的特异性和扩增DNA的产率，在反应体系中，由于DNA模板、引物、四种dNTP的磷酸基团，以及引物、模板原液中的EDTA等螯合剂都要结合Mg²,因此合适的Mg²浓度至关重要。一般的情况下，过量的Mg²会导致酶催化非特异性产物的扩增，而Mg²浓度过低，又会影响Taq酶的活性，使产物DNA量降低。为了选择到最佳的反应条件，在实验前，可设置在一定浓度的模板DNA、引物、dNTP和循环参数下，用不同浓度（如0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、……5.0mmol/L）Mg2 进行预实验。在确定大概浓度后，可在该浓度上以0.2mmol/L增减。10×缓冲液中用100mmol/L Tris-HCl是一种双极性离子缓冲液，以维持合适的pH的缓冲能力，10×缓冲液中的100mmol/L KCl是有利于引物的退火，但是过高的KCl将抑制酶的活性。缓冲液中的明胶、TritonX-l00是为了稳定酶不变性失活，有的反应中加入100mg/ml的小牛血清白蛋白或0.05%Tween20，以及5 mmol/L DTT，都是酶的保护剂。50%甘油是为使酶保存于-20℃时，不因结冰而失活。这些酶的保护剂如果浓度过高，特别是质量欠佳时，往往都抑制酶在反应中的活性，在使用时应特别注意。在反应体系中如果加入10%的DMSO（二甲亚砜）可以减少二级结构的形成，增加反应的特异性，但它对酶的活性也有少许抑制作用。
（四）反应体系加样顺序
反应体系一般为50～100微升体积，体系中加样顺序为dH₂O补充体积，10×缓冲液（体积1/10），4种dNTP（各20～200mmol/L），两条引物（各0.1～0.5mmol/L），模板DNA要根据其分子量而定，一般在102～105拷贝数；Taq酶常要稀释为2.5单位/100ml。为了防止高温反应时液体的挥发，常加入石蜡油封闭体系。
（五）脱氧核苷三磷酸浓度
脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）在反应中的浓度也非常重要，常用的浓度一般为20～200mmoI/L，而且四种dNTP的终浓度相等。高浓度会抑制Taq DNA聚合酶的活性，引起聚合酶催化错配，而且由于反应中dNTP结合Mg²的量较大，所以四种dNTP的量相应为Mg²的浓度提供参考。
（六）温度和循环参数
PCR扩增循环中的变性、退火、延伸的过程是反应体系在合适的条件下，通过不同的温度变化来实现的。在PCR中控制温度是关系到实验成败的重要环节。PCR的变性是实验进行的基础，如果加热的温度不能使靶基因模板和PCR产物的双链完全变性解离，则会造成PCR实验的失败。常用的变性温度是90℃～94℃，为了提高变性效果而又不影响酶的活性，可在加酶前于97℃变性5分钟左右，加酶后的循环变性中以93℃～94℃变性30秒；退火的温度依赖于引物的长度、浓度及碱基组成如CG的含量，一般为55℃ 30秒钟，引物的退火温度可根据Tm = 4(G C) 2(A T) 公式进行计算；PCR的延伸温度在70℃～75℃之间，常用72℃，延伸1分钟，延伸的时间要根据扩增DNA的长度而定；PCR循环的次数为20～35次，循环次数取决于模板DNA的浓度。循环的次数越多，反应非特异产物也越多，因此循环次数不宜过多。

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