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HLA基因分型方法：PCR－SSO（ASO）探针法

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-06 　本站论坛

PCR－SSO（ASO）探针法

1）常规提取DNA

参见RFLP法

2）PCR扩增

参见PCR-RFLP法

3）斑点杂交

1．将5～20μl扩增产物，加变性液100～200μl室温处理5～15min。

2．在尼龙滤膜（预先用2×SSC浸湿2min）上真空点样，每孔以10×SSPE 200μl冲洗，抽干，80℃干燥2h。

3．标记探针，取标记缓冲液2.5μl，寡核苷酸片段（dCTP, dGTP, dTTP）50～100ng，[γ-³²P]ATP 2.5μl，T4多核苷酸酶10U，双蒸水加至25μl，混匀，37℃保温45min，用0.5mol/L EDTA 1μl终止反应，标记的探针可直接使用或采用柱层析分离标记好的探针。

4．点样膜于杂交前漂洗，放入杂交袋中，加入适量预杂交液2ml/10cm²在杂交温度下预杂交10～60min，将适量标记探针加入预杂交液中，杂交1h～过夜。

5．洗膜，2×SSPE和0.1％SDS于杂交温度洗2次，最后根据探针的Tm值调整洗膜2次。

[1]

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