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7.DD法-mRNA差异技术

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-06 　本站论坛

　哈佛大学医学院的Ｐeng Ｌiang和Ａrthur Ｂ．Ｐardee博士发明的mＲＮＡ差别显示即DD法（differential display of mＲＮＡ by ＰＣＲ），是一种新的研究基因差异表达的有力工具。这个方法的离要程序是将细胞内的m ＲＮＡ抽提出来，反复录成cＤＮＡ，尔后经ＰＣＲ随机扩增，通过在测序凝胶上电泳条带的比较筛选出不同的表达的基因，并回收这些ＤＮＡ片段，经扩增后作为探针，在c ＤＮＡ或基因组ＤＮＡ库中扫描找到相关基因。原则上如果选用不同的引物组合，这个方法可以检测到细胞中约15000种不同基因的表达情况，这就给出了一个类似于蛋双向电泳的指纹图谱，基因表达的不同马上就可以知道，并因此分离到该基因。

　　由于这种方法主要依赖于ＰＣＲ技术，所以选择合知的引物是这一方法成功的关链。用于逆转录合成单链cＤＮＡ和ＰＣＲ扩增的３’引物设计得益于许多真m ＲＮＡ共有的polyＡ尾巴，所以oligo dＴ作引物就可锚定在polyＡ上。加之又在引物的３’端加了两个碱基，它们将随机地与mＲＮＡ的polyＡ上游两个碱基配对，由于这两个碱基有12种不同的组合，从而将有的mＲＮＡ分成12个组。这样就减少了每次分析的mＲＮＡ数量，提高了分辨率。后来这一引物的设计又得到了改进，将倒数第二个碱基改成了一个简并碱基，从而将３’引物的数量减少到４个，分别是５’Ｔ12ＮＡ３’、５’12ＮＧ３’、５’Ｔ12ＮＴ３’和５’12ＮＣ３’（其中Ｎ是d Ａ、dＧ或dＣ），这样就将所有mＲＮＡ分成了４组，这一改进既减少了引物的用量和需要分析的次数，又保证了足以灵敏地检测到所有可能的表达产物。

　　在获得cＤＮＡ以后进行的ＰＣＲ扩增中，５’所用的引物是一组随机引物，引物的选择关键在于它们的长度。理论上这个长度要满足两个条件：一是要和m ＲＮＡ有合适的配对效率，其次则是必须符合ＰＣＲ引物的要求。从为了获得较高的配对概率来讲，这个引物应足够短，以具有更高的灵敏度，６到７个碱基被认为是合适的长度。但是很明显，这样一个引物用于ＰＣＲ扩增是太短的，虽说在用ＰＣＲ研究ＤＮＡ多态性的实验中，8￣10个碱基长的引物也被应用，但一般ＰＣＲ所用的上物往往有20个碱基或更长。经过选择不同长度引物是适宜的，下表是实验的结果：

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随相引物的长度配对几率陈列的mＲＮＡ数

（个）

━──────────

（碱基数）（千碱基/配对位点）理论值实际结果

────────────────────────────────

6 4 150 0

7 16 38 0

8 65 10 0

9 262 2 20￣80

10 1049 <1 50￣100

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

　　从表中可以看出，实验结果和理论值有很大的差别。其原因可能是短的引物虽然具有较启的配对几率，却困为退火温度太低而使实际扩增数降低。相反地，10个碱基的引物具有足够高的退火温度，其实际扩增出来的数目出人意料地高，可能是因为ＰＣＲ开始几轮，相物和mＲＮＡ配对时，５’端是松散的，使得实际配对的碱基数少于10，所以大大地增加了配对的几率。这一设想可通过只改变５’ 端的碱基会得到同样的扩增结果来证明10个碱基长度的这些引物，扩增出来的条带的长度一般为100￣500个碱基，更适合于后来的凝胶电泳分析。从概率上来讲，在500 个碱基长的序列中存在任何一个这样的引物序列的几率是0.05，所以，有20个这样的引物就可以覆盖所有的mＲＮＡ顺序。当然这里的ＰＣＲ条件和一般的反应条件有所不同，同时要用35Ｓ的dＡＴＰ或dＣＴＰ标记，以便在电泳后进行放射自显影检测。

　　mＲＮＡ的扩增产物可以在４％和ＤＮＡ测序胶上电泳，然后作放射自显影。如果将不同的细胞可不同条件下处理过细胞的扩增产物并排走一起，我们就很容易辨别出它们的表达差异。而且，这些条带可发言人人凝胶中回收，经第二轮ＰＣＲ特异性扩增后获得卟够的量，用于制成相应的探针，来找出未知的差异表达的基因。

　　由此可见，这一方法可以替代80年代就已发展起来的差减基因克隆的方法。那么，它和差减法相比有什么优点呢？归纳起来有以下几个方面：

　　1．简单易行：这一方法主要依靠的技术只有两种，ＰＣＲ的ＤＮＡ测序凝胶电泳，而这两种方法都是非常成熟的。

　　2．灵敏度高：用这种mＲＮＡ差别显示技术，只需要20μg的mＲＮＡ，而差减法则需要至少200μg的mＲＮＡ或细胞总ＲＮＡ。

　　3．重复性好：90％￣95％的mＲＮＡ可以被重复显示。

　　4．多能性：一次实验可以比较很多个不同的种类，而且它可以进行细胞间的双向比较，所以不仅能显示例如癌基因的表达，而且可以检测到诸如抑癌基因一类基因的表达。

　　5．快速：应用这一方法，两天之内可以检到mＲＮＡ的差异，从重新扩增到Ｎorthern杂交一般只需一周的时间。而且，这一方法从头至尾，我们都可以监测它的进行情况，而不象其它方法那样要到最后才能知道系统是否工作。

　　正是这些显著的优点，使得这一方法得到了格外的重视，在很多场合加以应用。首先是用来快速分析细胞在不同条件下基因的表达差异，其次是用于快速克隆有表达差异的基因。这里最典型的例子是肿瘤细胞和下沉细胞的表达差异的研究，如α-integrin从乳腺癌细胞中的克隆即是用了这一方法。随着越来越多的人知道并动用它，这一方法在细胞内信号传导、细胞周期调控和发育等方面的研究中也将是非常有应用前途的。

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