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17.cDNA库特异序列之PCR扩增

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-06 　本站论坛

最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋白质序列结构的资料。聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特异DNA扩增几百万倍，并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。最近，TAQDNA聚合酶的使用极大地简化了PCR方法。该酶在75℃左右有很宽的最适温度区，在小于95℃以下重复保温仍能存活，更重要的是，该酶活性高，无外切酶活性，因此理论上不用通过建立和筛选基因库的所用步骤就能从序列编码的基因作模板以探索一种简单．快速的基因分离方法。下面我们将描述在鉴定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和过程。
　　Dr.S.Gardell(MSDRL，WestPoint，PA)纯化了从南美蝙蝠唾液腺中分离的一种外分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet)是开始本实验的关键。为检验不用传统筛选方法即能克隆该蛋白基因的假说，我们采取了如下策略:

　　a).在Lambdagt22中建立一个在蝙蝠唾液腺中所有转录子的cDNA库，并在边侧加上SP6、T6聚合酶启动子，这样可以直接用两种启动子序列之一作引物进行扩增和测序。

　　b).合成四组引物，组合起来代表已知的部分蛋白序列的全部有效密码子组合 (1024种衍生列)。C).这些引物与适当的T7或SP6聚合酶序列引物组合成对，以总cDNA 库作模板，进行PCR扩增。所得到PCR产物应该代表编码该蛋白的部分cDNA。对这些 PCR产物直接测序应能得到足的序列信息以合成同源引物，进一步进行PCR扩增，产生的DNA片段结合起来可给出编码该蛋白的cDNA的完整序列。

　　直接用2%琼脂糖凝胶分析PCR产物，组混合引物[引物1:5’(CT)TXGG(ACGT)TG(CT) GA (CT)(CT)TXATG3’，。每组混合引物产生约450bp和550bp的两个产物。用Wong等所述的方法进行凝胶纯化和测序该PCR的主要产物450bp带。混合引物产生清蜥可读的序列(约200个核苷酸)，虽然可有256种引物组人合(简并度)。在这个序列信息的基础上，合成另两组引物[引物Ⅱ(正向)]分别与SP6或T7聚合酶序列引物配对，按前面所述进行PCR扩增，引物Ⅱ/SP6和引物Ⅲ/T7分别产生270bp和420bp片段，测定这两个片段序列，与最初得到的DNA片段结合来，得到一个467bp编码序列。该cDNA(270BP+420 bp)的多余序列为200bp的PolyA尾序。

PCR策略

　　(A)n、(C)n、(G)n、(T)N:同聚物序列SP6，T7:SP6和T7聚合酶启动子，分别构建入Lambdagt载体。B.琼脂糖凝胶分析PCR产物。PCR在总体积100μl，含50mMKCL、 10mMTris，pH8.3，1.5mMMgCl2，0.01%明胶，200μM每种dNTP，2.5uTup聚合酶， 150ng噬菌体库模板DNA，50ng(0.1nmoles)每种引物的体系中进行。程序如下:初始模板变性94℃，8分钟;之后为94℃2分种，60℃3分种，30个循环。PCR反应产物用氯仿抽提以除运送放物油，从100μl中取5μl样品加到2%琼脂糖凝胶上。溴化乙啶染色。

　　GGATGACCACCCACAGCAGCTGCCTAACCATGAAGCTGGTGACCATCCTCATGCTGACC

　　GCCCTCCCCCTGTACTGETATGCGGGGCTTGGELGEGATCTTATGGACAATGTGGTCAAR

　　TTGACCATCGATTCTAATGTGGACGTGAATACATACATCGATAACCTGAAAGAGTTCCTA

　　CCAGGTGAAGAAACTCAAGAGGCCTTCAAATTCATGAAGGAATGCTTTETCGATCAGAGC

　　GAAGAAACTCTGGAGAAGATCAAAGTTCTGCAGCAATCGATATACAGTAGCGTTTGGTGT

　　GCTCGGGACACTAACTTCACATGACCACAGAGATTGTCCACAGACCAACTGTCCATTGG

　　TAGAAGCCECAGCTGAGCTTTCCTTCTTCATCCTTCGATCTACAAATGCAAGACAATTGT

　　AAACCTGACATACGTTTGEATTTCAATAAAGCATCCTGCAAAACCAAAAA

　　核苷酸序列及预测的氨基酸序列。从制备性琼脂糖凝胶中分离PCR产物，并按厂商说明书(Bio101)用Geneclean纯化。按厂商说明书(美国Biochemical序列酶)，用 32P5’末端标记引物和修饰过的T7聚合酶(测序酶)测序。每个反应含100ng(0.4pmoles )模板DNA和20ng(4pmoles)5’32P末端标记的引物，每反应为2卓106cpm。划线部分为起始本实验的多序列。计算机分析表明该cDNA含有一个可读框，编码110个氨基酸，起始的18个氨基酸推测为信号肽，还发现用于起始这种蝙蝠唾液蛋白实验的七个氨基酸在蛋白的N-末端(图2，划线部分)。检索NBRF数据库揭示该蛋白与鼠前列腺类固醇结合蛋白C3链前体有39%的同源性，最重要的同源性是成熟蛋白中所有三个半胱氨酸残基的位置。

　　我们已经证明聚合酶链反应可以用于从复杂分子库如cDNA库扩增特异的DNA序列。在本实验中专门设计的Lambd gt22载体，通过用含有适当内切酶位点和聚合酶启动子序列的5’端、3’端引物接头定向克隆cDNA分子。从克隆的PCR产物制备序列特异的探针，用传统方法筛选基因库，我们估计分离cDNA的丰度为每10，000个噬菌体重组子中有1个克隆。用一组代表简并度为256的寡聚核苷酸引物能进行特异扩增的事实进一步表明了该方法的灵敏度，而且如图1B所示，所有四个引物混合物产生相同PCR 产物，表明具有更大简并度的寡聚核苷酸引物库也能进行特异扩增，PCR可以容忍1个碱基对的错配。

　　PCR方法、混合引物和PCR产物直接测序结合起来，可极大地减少建立cDNA库的时间，扩大该方法的用途。

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