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RT-PCR应用(1)

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-24 　本站论坛

7. 5' 和3' RACE
RACE（cDNA末端快速扩增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一种获得转录本5'或3'未知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3' RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（5' RACE）。RACE已经被用于扩增和克隆稀有mRNA。RACE的产物可以用来克隆，直接测序，制备探针或连接在一起得到全长cDNA。其中一个连接5' 和3' RACE产物的方法是使用由5' 及3' RACE得到的序列信息设计新的引物，以扩增全长的cDNA。使用RNaseH-的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真的扩增，从而得到全长cDNA克隆。
5' RACE步骤概要：第一链引物，GSP1，同mRNA退火；使用SuperScriptⅡ将mRNA转录成cDNA ；使用RNase混合物降解RNA ；使用GlassMAX? Spin Cartridge纯化cDNA ；使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾；使用简并的锚定引物和巢式GSP2 PCR扩增带有dC尾的cDNA ；使用AUAP，UAP和巢式GSP重新扩增初步PCR产物。5' RACE比RT-PCR更具有挑战性，特异性也较低，因为只有一个引物是基因特异性的。5' RACE的产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增的GSP的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA的复杂度和丰度及产物的长度。使用巢式引物扩增（最多可以三轮巢式扩增），并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为模板可以增加5' RACE的特异性。增加逆转录保温温度和PCR退火温度，并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性。 5' RACE的灵敏度受所使用的逆转录酶和cDNA 3' 末端抑制cDNA加尾（tailing）的二级结构影响。cDNA的不完全合成降低了全长产物的产量，并导致某些模板产生连续条带。因为SuperScriptⅡ产生更多的全长cDNA，所以可以提高5' 末端序列检测的水平，尤其是对于小于1kb的转录本。双链3' 末端和发卡结构会通过减少用于加尾的3' 羟基而破坏cDNA的加尾。cDNA的起始保温温度在94℃并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构。一些困难模板可能需要加入DMSO辅助加尾。加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多20％的DMSO。在45℃使用SuperScriptⅡ从5μg Hela总RNA合成cDNA。10μl纯化的cDNA在10％DMSO中加尾。使用人tuberous scleosis的引物和ELONGASE? Enzyme Mix（初步PCR 2.8kb；泳道1）对1μl加尾反应产物直接扩增40个循环。在2.8kb条带周边移取10μl的凝胶。使用1μl限定大小的PCR产物进行巢式PCR（巢式PCR 2.7kb；泳道2）。凝胶使用SYBR? GreenⅠ染色。巢式PCR后如果看不到产物或仅观察到连续条带，可以使用Southern印迹检测产物。这需要了解序列内部信息以制备探针。仅扩增全长cDNA末端的高级RACE方法
为了获得全长的cDNA 5'及3'末端序列，许多研究人员使用称之为cDNA末端快速扩增，或RACE的方法。传统的RACE方法得到的PCR产物含有全长及断裂的cDNA产物。GeneRacerTM试剂盒确保只得到含有全长cDNA末端的完整序列，使您得到更高效的结果并节省时间。
GeneRacer?的优点：确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅读框至关重要。GeneRacer?是一种高级RACE技术，提高了扩增全长cDNA末端序列的效率。使用GeneRacerTM试剂盒，可以得到：完整序列：克隆基因片段的全长5'和3'末端以构建完整的cDNA序列；灵敏：得到每个细胞中拷贝数低至30的稀有转录本的全长5'和3'末端；长度：可以由转录本得到长度至少为9kb的cDNA ；仅通过一轮PCR反应就可以得到这些结果。一般不需进行巢式PCR。
全长5'末端选择
传统的RACE会得到多个PCR结果，因为其所使用的cDNA来源于断裂及全长mRNA。研究人员必须鉴定每一个 PCR 产物以获得带有全长5′末端序列的产物。GeneRacer? 只针对全长的5′加帽mRNA，从而节省了花费在筛选大量PCR产物上的时间。图13 示意GeneRacerTM 的工作原理。RNA样品经CIP和TAP处理，保证GeneRacer? 寡聚RNA仅同全长转录本连接。然后使用SuperScriptⅡ逆转录酶对这些转录本逆转录，得到的cDNA做为PCR的模板。GeneRacer? 寡聚RNA序列做为GeneRacerTM 5′引物结合位点，这样，只有具有全长5′末端的cDNA才会被扩增。使用GeneRacer? 步骤及高保真度Platinum? Taq DNA聚合酶，就可以确保得到最高效的实验结果。
3.5mg Hela总RNA经GeneRacer?步骤处理，利用GeneRacer?的Oligo dT引物和SuperScriptⅡ?得到cDNA，然后使用GeneRacerTM 5′引物和基因特异性的引物PCR扩增。基因经过30-35个循环的一轮PCR扩增。50ml PCR扩增产物中的15ml在1.2％E-Gel? 琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下观察。
泳道1: HPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），1.3kb，30拷贝/细胞
泳道2: SMAP（胸腺激素受体共激活蛋白），3.1kb
泳道3: Cleavage and polyadenylation specificity factor，4.5kb
泳道4: TFRC（转铁蛋白受体），5.0kb
泳道5: IGFⅡR（类胰岛素生长因子Ⅱ受体），9kb，5′末端GC含量90%
敏感性和扩增长度
为了说明GeneRacer?试剂盒获取全长5′末端的能力，我们扩增了带有已知转录起始位点的基因的5′末端。使用总RNA，遵循GeneRacer?步骤，我们扩增了一个长转录本（9kb）和一个浓度为0.01%，即30拷贝/细胞的稀有mRNA。
长度超过GenBank序列
除了可以获得已知转录起始位点基因的全长5′末端，GeneRacer?还可以获得未知转录起始位点基因的5′末端。将GeneRacer?所得到的序列同GenBank列出的mRNA序列相比较，GenBank的序列一般来源于使用传统方法构建的文库中的cDNA，这导致末端核苷酸的缺失。从表4可以明显看出，使用GeneRacer?得到的5′cDNA末端要比GenBank中列出的序列长16到116碱基。
Gene GenBank Number(mRNA) Size(kb) GeneRacer? Sequence Beyond GenBank
Heterogeneous nuclear ribonuclear protein complex K protein(hnRNP K) S74678 2.3 +62
Subunit for coatomer complex X70476 3.1 +38
Muscle phosphofructokinase(PFKM) M26066 2.8 +16
ADP-ribosylation factor 4(ARF4) M36341.1 1.5 +116
Isoleucil-tRNA synthetase U04953 4.5 +49
Putative tumor suppressor(LUCA 15) U23946.1 2.6 +81

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