| 差示反转录PCR[mRNA差异显示技术] | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-07 本站论坛
|
|  |
⑨ 4℃，12,000g，离心20分钟。
11小心移取上层水相。
12加入10ml异丙醇，放置-20℃至少30分钟沉淀RNA。
134℃，12,000g，离心15分钟收集RNA
1475%乙醇洗涤沉淀。
15加入200mlRNase-free水溶解RNA沉淀。
16溶解的RNA-70℃保存。
（4）总RNA的检测
GeneQuantⅡ核酸定量分析仪测定、260nm、280nm的吸收值及二者的比值、RNA的浓度、蛋白浓度等。
快速电泳RNA的完整性，电泳条件：0.7%琼脂糖胶，1×TAE，10~15V/cm。
2.2反转录
在0.2ml离心管中加入下列试剂：
2mM Oligo(dG) 2ml
总RNA 3.060mg
2.5mMdNTP mix 4ml
Rnase-free H2O →12ml
混匀，65℃保温10分钟，立即置冰上，简单离心然后加入下列试剂：
5×First-Strand Buffer 4ml
0.1M DTT 2ml
40U/ml RNasin 1ml
轻弹混匀，42℃保温2分钟，加1ml SuperScriptⅡ反转录酶，混匀，然后42℃，温育50min; 70℃，15min以灭活反转录酶。
2.3 PCR扩增
20mlPCR反应体系中含如下试剂：
ddH2O 10.04ml
25mM MgCl2 1.20ml
10×PCR buffer 2.0ml
2.5mMdNTP 1.6ml
2mM Oligo(dG) 2ml
2mM随机引物 2ml
5U/mlTaq酶 0.16ml
摸板（cDNA第一链） 1ml
PCR扩增程序为：
95℃预变性5min；
30个PCR循环：95℃变性1分钟，40℃退火2分钟，72℃延伸1.5分钟；
72℃延伸10分钟。
.2.4 DDRT-PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
（1） 配制以下储备液
A．40%丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺（Acr） 380g
N,N-亚甲双丙烯酰胺（Bis） 20g
双蒸水 →1000ml
过滤，4℃储存备用
B．10×TBE
Tris Base 216g
硼酸(Boric acid) 110g
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 74.5mL
双蒸水 →2000ml
C．10%过硫酸铵
过硫酸铵 1g
H2O 9g
-20℃保存。
D．0.5M EDTA
Na2-EDTA·2H2O 186.1g
双蒸水 →1000ml
用NaOH调至pH8.0，灭菌。
E．上样缓冲液
8%去离子甲酰胺
10mM EDTA(pH8.0) 1ml
0.01%二甲苯青
0.01%溴酚蓝
（2） 6%序列胶配制
尿素 59g
40瑀-Bis 18.0ml
10×TBE 12.0ml
10%AP 300ml
TEMED 30ml
甲酰胺 10ml
ddH2O →120ml
让其聚合至少2小时以上，1×TBE作为电泳缓冲液，预电泳30min，上样前冲洗上样孔。
（3） 玻璃板的清洁准备
用洗涤灵将玻璃板清洗干净，自然晾干或用吸水纸将水珠擦干，再用95%乙醇擦洗干净，自然晾干。
在平玻璃板上涂上1.5ml0.2%Binding Silane（在1.5ml离心管中加入3uL Binding Silane和3uL冰醋酸，补足95%乙醇至1.5ml），然后再用酒精擦干；耳朵板涂上2%的Repel Silane，再用95%酒精擦干，装配两块玻璃板。
（4） 6%聚丙烯酰胺（PA）胶的制备
6%PA胶 50ml
10% 过硫酸胺 250ml（冬天）/150uL（夏天）
TEMED 50ml
摇匀后灌胶，将玻璃板30°角倾斜放置，从顶端一角缓慢灌入凝胶溶液，注意防止产生气泡，灌满后放平玻璃板，立即插入鲨鱼齿梳子，待胶凝固，聚合至少两小时以上。
（5） 上样、电泳
①在扩增产物中加入 uL 上样缓冲液，95℃变性8分钟后立即置冰上。
②将胶板安装在电泳槽内，准备电泳，电泳缓冲液为1×TBE
③将胶面沉积的尿素和气泡清洗干净，插入鲨鱼齿梳子。
④预电泳：恒定功率70W约30分钟左右。
⑤加入已变性的扩增产物 6uL，70W恒功率电泳约2.5小时。
⑥电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶将粘在平玻璃板上。
（6） 银染检测
①脱色与固定：电泳后将平板放入10%的冰醋酸中，胶面朝上，在水平摇床上脱色30分钟至指示剂无色。
②水洗：蒸馏水洗两次，各5分钟。
③银染：将平板放入银染液中（1g AgNO3 1.5mL 37%甲醛 1LH20），于摇床上轻轻摇动30分钟。
④显影：用蒸馏水中冲洗一下（＜10秒＝立即放入预冷的显影液中（30g无水碳酸钠溶入1L水 1.5mL甲醛 200uL 10mg/mL硫代硫酸钠，置于4℃）直至DNA条带显出。
⑤定影：将胶板拿出放入10%的冰醋酸固定液，轻摇1-2分钟。
⑥冲洗：用蒸馏水冲洗1-2分钟。
⑦胶的干燥：室温下自然晾干。
⑧照像，保存图像。
差异cDNA片段的回收
用刀片将要回收的目标条带割下，小心移至0.5ml离心管中，加入20ml无菌水，100℃水浴煮15min，取出，冷却后保存于-20℃备用。
② 异硫氰酸胍变性匀浆液
异硫氰酸胍(guanidine isothiocyanate) 25g
CSB缓冲液 33ml
混合，完全溶解后4℃保存备用。
③ 2mol/L乙酸钠(PH4.0) 0.1%的DEPC处理
④ 75%乙醇 用RNase-free ddH2O配制
上一篇：Rt-PCR实验步骤 下一篇：Gene-specific RT-PCR 共2页: 上一页 [1] 2 下一页 | | |
|
|
|
![差示反转录PCR[mRNA差异显示技术]](/images/logo.gif){kind=logo}
