分子信标（molecular beacon）
分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
TaqMan 探针 TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
LUX Primers LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。与 Taqman 探针和分子信标相比， LUX 引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为 LUX 引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。
PCR 产物的定量检测1、 凝胶检测系统 ：凝胶检测系统用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量, 放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定。最近,有用自动DNA 测序仪检测荧光标记的核酸, 这种方法可准确测量扩增产物的大小, 而且其检测灵敏度可达fg 水平, 但由于自动DNA 序列仪和荧光标记引物极为昂贵, 所以现在仅用于研究。
2、 HPLC检测系统 ：HPLC检测系统的优点为PCR 产物不用纯化,对未标记的产物灵敏度可达fg水平,对标记产物的检测限度可能更低。HPLC 能区分不同分子的大小,可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
3、 固相测定系统 ：固相测定系统最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板,可用仪器比色或读数。可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板,此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量, 如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量。将生物素和地高辛同时标记PCR 产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dU TP); ②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP; ③加入生物素化引物2和地高辛标记的引物2。定量方法为: 双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物,然后加至亲合素包被的微量滴定板上温浴至少2小时,洗涤数次后,与DIG 抗体和AP结合物温浴,根据其底物不同可产生不同的颜色。亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵敏和容易操作的技术,将成为定量PCR的一个关键技术。
4、 SPA系统 ：SPA (Scintillation Proximity Assay) 系统用亲合素包被的氟微球作为固相载体, 用生物素标记引物, 在扩增时掺入氚化的核苷酸, 扩增完成后,加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR 产物, 此捕获过程可使氚与氟微球紧密结合, 氟被氚激发产生光脉冲, 可用闪烁计数仪测量。与比色法相比,此法具有更大的线性范围。
5、 杂交检测系统 ：将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面, 与标记的DNA 探针杂交,亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T ) 尾巴固定于膜上,与变性后的已标记的扩增产物杂交。在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面, 故其反应动力学接近于液相, 反应速度快。通常使用生物素化的探针或扩增产物, 用亲合素2AP结合物产生颜色斑点,通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
6、 电化学发光检测系统 ：通过亲合素2生物素系统将扩增产物结合于磁性珠, 然后与2,2′-联吡啶-2钌螯合物(TBR )标记的探针杂交,加入三丙胺(tripropylamine,TPA )溶液,并转移至电化学发光仪的检测池,当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化,TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质,可与氧化的TBR反应,使之进入激发态,当由激发态变为基态时可发射出620nm的光。发光强度与TBR标记物的量成正比,通过发光强度对PCR产物定量。此法的敏感性很高,可自动化测量。
7、 DNA酶免疫测定系统 ：通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合, 再通过酶-第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记, 但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。
8、 激光诱导荧光检测法 ：首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨己基连接臂偶联于正向引物的5′-核苷酸上,然后PCR扩增,用毛细管电泳扩增产物,最后用氩离子激光光源检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少,可自动化检测, 快速、灵敏和高分辨率。
实时荧光定量PCR的特点1. 敏感性 实时荧光定量PCR技术的敏感度通常达10?拷贝/ml，且线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内FQ-PCR定量较为准确，标本不需稀释。同时实时荧光定量PCR应用了光谱技术,与计算机技术相结合有较多的优点,有效的减少了劳动量。如Taqman PCR使用氩激光来激发荧光的产生 ,利用荧光探测仪检测荧光信号的大小,通过计算机的分析软件进行分析,灵敏度达到了极限 ,可以检测到单拷贝的基因,这是传统的 PCR难以做到的。敏感性大大提高。
上一篇：原位PCR介绍 下一篇：多重PCR
共4页: 上一页 [1] 2 [3] [4] 下一页
