| 生物药品“植物制造” | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-08 本站论坛 |
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如果不需要考虑国际规范，技术难关，以及安全性命题，仅按字面意思理解的话，生物制药也许本来可以简单到直接在树木上生长出药物。
在2005年9月的联合国世界政府首脑峰会期间，联合国秘书长科菲.安南呼吁对千年发展目标（MDGs）施以更强烈的支持。这些目标，包括在2015年前寻求治愈大部分全球性社会经济弊病的途径，以及在发展中国家和发达国家之间搭建共同条约的基础。
在8个千年发展目标中，有两项与疫苗接种和传染性疾病直接相关。第三项则是寻找为发展中国家提供他们能够负担得起的必须药品，以及与私人部门经济合作谋求新技术的利益。考虑到每年有成百万的人口由于缺乏有效的药品和疫苗，不必要的丧生，遭受疾病或生存环境的折磨。必须的药品除了能够挽救生命，增强健康体质，还应该是人们能够得到并且经济上可以负担的高质量的药物。
目前的研究提示了开展分子农业的前景，利用植物生产药品可能会为成功制造一系列在研究和诊断中使用的蛋白质提供一条有效的途径。
利用植物生产药用蛋白具有以下若干优点：成本低于以微生物发酵、昆虫和哺乳动物细胞培养为基础的传统方法。一些研究结果表明植物生产重组蛋白质的成本仅为微生物发酵系统的10%，或者哺乳动物细胞培养系统的0.1%。当生产高产蛋白的时候，植物的经济学优势是其它方式难以望其项背的。
另一项利用植物生产药品的主要优点在于能够进行快速评测的潜力。位于美国北加州的Biolex Therapeutics公司利用一种小型绿色水生植物浮萍Lemna生产重组的人体治疗用蛋白质。“从进行转化工作开始，到制造出转基因植株，我们只花费了3~4个月的时间就得到了能够投入生产的流水线，”公司的研发副总裁Lynn Dickey博士介绍到。
作为生物工厂的植物
利用植物进行大规模的生长、收获和处理药用蛋白质在技术上是可行的。经过基因修饰的作物包括可食用的疫苗，包括可以直接食用的或只需要经过部分处理的植物。通过将蛋白质表达定位于植株的不同器官，如种子，从而创造出一个稳定的储存系统。将重组蛋白定位于细胞不同的亚细胞区域，如内质网——一个有利于它的正确折叠和组装的适宜环境，就能增加重组蛋白的生产总量。此外，对重组蛋白进行膜定位还有利于对产品的富集，从而使用于下游的纯化工作的成本最小化。最后，利用植物生产药物与通过动物或人体资源进行的生产不同，能够降低被来自人或动物体的病原体污染的风险。
到目前为止，利用植物生产药用蛋白质能够被分为以下3种：人源生物药用蛋白，包括生长激素，人血清清蛋白，β-干扰素，以及红细胞生成素；重组抗体，如IgG1、IgM；以及重组亚单位疫苗，针对诸如乙型肝炎表面蛋白，狂犬病毒糖蛋白，以及霍乱毒素B亚单位。
重组蛋白质表达水平的高低决定了分子农业能否成功产业化。在目睹了2003年度美国CropTech公司由于不能达到进行产业化生产必需的表达水平而导致破产之后，产量无疑成了核心问题。“产量是一个临界点，”费城托马斯杰佛逊大学的Hilary
Koprowski博士是探索利用植物表达动物蛋白这一领域的先驱者，他谈到：“你能够通过扩大植株的种植量来克服这一点，而且这样做显然比使用哺乳动物细胞时要方便得多，但是这样做的同时，我们还是更倾向于依靠增加单产来提高产量。”
选择用于生产的植株对于决定产量是关键。常用作物可以分为下列4种不同的植物：多叶的植物，如烟草、紫花苜蓿、莴苣和大豆等；谷类以及荚果类；果实和蔬菜；以及纤维类和油类作物。其中每一种都各有利弊，通常仅作为执行生产重组蛋白功能的载体。
生产蛋白质的烟草
烟草是在实验室研发水平用来生产重组药用蛋白质时最广泛使用的一种植物。圣路易斯的植物生物工程公司Chlorogen就选择了烟草来生产它的重组蛋白。“烟草已经经过相当长时间的应用了，它的作用类似于实验用的大鼠，”该公司的总裁和首席执行官David
Duncan博士说到，“烟草不但很容易进行转化操作，而且还是仅次于甘蔗的地球上第二大生物量生产者。烟草也是一种在一个生长季节能够收获多达5茬的作物，并且在收获后仍然在原始植株上进行再生长。与其它植物比，烟草的另一个优点是自花授粉，因此，即使某一个内在机制如母源性遗传被破坏了，仍然可以有效的降低交叉污染的可能性。”
引入由感兴趣的基因所编码的蛋白质的过程被称为转化，通常会使用两种手段。一种是通过载体介导，由植物寄生性的土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，向宿主基因组中引入外源性基因。另一种方法是基因枪法，将有DNA包被的微弹加速后射入植物组织中。
在经历转化过程之后，在各个阶段中基因表达和蛋白质稳定性的效率都需要进行最大化。启动子序列以及多聚腺苷酸信号序列对于高水平的转录都是关键性的影响因子。强大而且构成性表达的花椰菜花叶病毒的启动子35s（CaMV35S）就是经常选用的组织特异性启动子，该启动子仅仅在植物体的特定器官内才具有活性，且具有可以避免在营养器官内发生蛋白质积累的优点，从而防止对宿主植株以及接触非靶点器官后产生毒性。最后，可诱导的启动子能够允许目标蛋白的合成仅发生在某个特定的时期。
亚细胞定位是影响蛋白质生产的另一个重要因素。细胞内的区域化能够影响到蛋白质折叠，聚合，以及转录后修饰的过程。而这些都会影响到蛋白质的稳定性，从而间接的决定最终产量。比较性的定点实验的结果表明利用植物或者动物中使用的N端的信号肽将蛋白定位到分泌途径上，是一处适宜折叠和聚合完整的免疫球蛋白和单链Fv片段的区域。一些对于蛋白质折叠和聚合具有重要作用的因子都出现在内质网的附近：这里是一个氧化性的环境，缺乏蛋白酶，并且含有丰富的分子伴侣。在缺乏定位信号的时候，蛋白质会在细胞外的空间内积累。
定位于叶绿体
叶绿体是植物体内另一个可供定位的细胞器。已经报道过一些基于叶绿体的分子农业的事例。能够对叶绿体进行遗传转化的重要性是基于以下两个重要的原因。第一，叶绿体是母源性遗传的，因此不会通过花粉传播到其他具有生殖匹配性的植物上。在考虑到基因转移可能造成的环境污染时这将具有重要的意义。第二，与目前使用的细胞核转化植株相比，利用叶绿体进行转化，生产蛋白质要有效数百倍。“回溯到20世纪80年代，人们发现每个细胞内含有约100个线绿体，每个叶绿体内拥有百份左右的DNA拷贝，”Duncan介绍到，“换言之，你就能在一个细胞内获得1万份的外源基因拷贝，我们称之为超表达。”
但是，叶绿体本身不具有进行大部分转录后修饰作用的能力，如糖基化。因此植物来源的重组蛋白通常缺乏哺乳动物细胞内常见的末端半乳糖残基和唾液酸残基的修饰，却具有糖基化的α-(1,3)岩藻糖和β-(1,2)木糖，前者在哺乳动物细胞内通常形成α-(1,6)的连接方式，而后者未见于哺乳类，而只在无脊椎动物中出现。。这一“外源性”的聚糖结构影响了人体利用和接受植物制造的蛋白。为了改进，研究人员已经在尝试使用纯化的人源性半乳糖基和唾液酸转移酶，在体外条件下修正植物来源的蛋白质。
最后，生产重组行性蛋白的成本还取决于要求达到的纯度，因为超过85%的开销都反映在下游的处理过程，而非生产中。植物这方面的优势在于一些重组蛋白可以在原始的或者部分处理过的材料条件下使用，从而显著的降低了成本支出。
分子水平上的一些对策已经被开发用来降低下游处理中的成本，例如将蛋白富集到细胞膜上，然后再通过膜的分级分离的方法纯化。或者定位到分泌系统也同样具有优势，因为经过这样加工的蛋白就不再必须对植物细胞进行破碎处理了。
市场机遇
植物制药所表现出的快速可评测性以及低廉的生产成本使科学家和实业家们对于生物农业的未来都充满斗志。Kisung Ko博士是Koprowski在烟草中获取临床应用级别的单克隆项目的合作者之一，他介绍说：“一旦能够正确的表达蛋白，就能形成双赢的局面。”Duncan补充道：“对于未来我很乐观，我认为我们，包括欧洲同行们，都面临着重要的转折。”来自科学家们的热情也同样被商业分析家们感受到了。对于他们而言，植物生物农业是一项在大规模生产重组蛋白质工业中具有货真价实的竞争力的方法。
去年12月，来自Frost & Sullivan的咨询顾问发表了一项关于生物农业市场的分析，分析的注意力主要集中关注北美和欧洲。随着对生物制药的需求增加，以及不同民众对转基因作物的接受度提高，北美将有望成为植物分子农业最大的市场。Frost & Sullivan的报告预测在未来20年以内，仅仅美国市场的价值就可能达到22亿美元。报告中指出：“对于暂停转基因作物的逐渐松懈是一个良好的征兆，表明公众和法规对于转基因作物的感受度正在不断改善，并且该潮流无疑是市场走向的指针。”
在药用蛋白中，治疗用单克隆抗体（mAbs）所获得的巨大成功——自1997年起便已占据FDA批准的mAbs的一半以上的份额——已经激起了业界对新的医学应用的狂热探索。仅在肿瘤学一项，NIH就正在为超过250项以上的临床试验征询志愿者。多样化的需求，诸如针对淋巴组织瘤和黑色素瘤等的抗癌疗法，以及阿兹海默症的治疗，都对这些药用分子提出了更高的要求。而在诸如大洋洲，非洲撒哈拉以南，以及南亚等许多地区，还需要进行常规的免疫诊疗法。
但是，在2005年6月，不论是植物中生产的mAbs还是疫苗都没有任何市场产业化行为。塔夫茨（Tufts）的波士顿药物发展研究中心拥有唯一一份关于植物生产的治疗用单克隆抗体临床研究的记录。该抗体名为CaroRxe，是由加州Hayward的星球生物技术有限公司研发，可用于预防龋齿。根据塔夫茨的记录，仅有两个公司的使用植物制造疫苗的项目进入了临床研究阶段。加州Vaccaville的大规模生物学公司（Large Scale Biology Corp）已经完成了它的人乳头瘤病毒疫苗项目的临床前期验证，德州大学城的ProdiGene公司则开发了一支可以抵抗大肠杆菌某毒性菌株的疫苗。
严酷的竞争
虽然学术界和生物技术生物制药界都在使用最具有创新性和最精巧的生物技术手段试图将植物转变为生物加工厂，但是要想在这个制药的新市场中实现有效率的竞争仍然是困难重重的。跟据塔夫茨研究中心的高级研究员Janice Reichert博士介绍，大多数的生物制药公司实际上并不是十分热衷于开发他们独有的产品。目前，大部分的公司都只是在概念性验证的水平上保持他们在植物中表达的方法多样性。Reichert认为，他们目前缺乏的是一个已经完成全套搜索一个正确的mAb候选的公司。“大部分的该类公司都没有他们自己的mAb。他们中大部分都需要的是一个愿意与他们一起探索植物生产的合作者。”
Sue Mayer DVM博士是英国基因观察（GeneWatch）的执行主管，他提醒人们通常遗忘了这些产品必须应该在临床条件下工作。“人们以为他们所需要做的一切仅仅是将一个疫苗弄到植物里面去就完成了，但是实际上那个疫苗必须要能够正常地工作，要能够引发正确的免疫反应。我们感觉这才是最大的难题所在。”
Koprowski认为，生物制药团体应该尽力争取获得制药工业和投资者们的信心。“一旦制药工业认识到在植物中生长疫苗可能产生的后果，这些团体就能逐渐的获得信任，从而最终能够制造这些产品。”他说，并进一步强调利润将增强他们的信心。“疫苗在第一年的盈利将非常低。你必须要获得一定的市场份额，必须要告诉医生和兽医们如何有效的使用它。但是在我看来，它们才是未来疫苗的希望。”
但是Reichert也认为还有许多需要努力的地方：“去年早期我曾经参加了在蒙特利尔举行的Plant-Made医药会议，发现即使在业界内部对于能否用植物生产（药用分子）也心存疑虑。这一领域还大有潜力，但是无疑还有一些关键性的问题需要解决。”
确实，对生物制药进行效能价格核算的重要限制之一在于最终产品的生产。最终产品的质量会受到产品结构的可靠性以及在不同收获之间的均质性的影响，因为必须要考虑到每株植物所处的土壤和气候的条件是有所不同的。
另一个主要的限制因素在于必须要解决来自生物安全性方面的顾虑，这和其他经过遗传修饰的作物类似。虽然通常认为植物合成的药用蛋白质比其他微生物和动物来源的更安全，因为排除了内毒素和病原体的污染，但是同时生物安全性还会顾虑到包括在纯化后的产品中含有杀虫剂的潜在可能，以及在转化植物时使用病毒DNA序列可能导致的不可预测的后果。
对环境的威胁
大量重组蛋白质渗入土壤和地下水的可能性是环保人士主要的关注对象。在经过遗传修饰的植株和它们的野生型之间也可能发生交叉污染，从而影响到土壤中生活的微生物、昆虫和动物。“我不支持在户外种植能够生产疫苗的植物。这些植物只应该在温室中生长。这样才能将可能的安全性问题局限在那里，”Koprowski说道。
“如果他们引用经济学作为论据，那么修建一个高度密封温室的必要性，就会使我们的优势不翼而飞。”这是Reichert的观点。
Mayer也表示赞同：“在田野里耕种的成本是非常低的，但是在高密封度的设备中进行生产就难以维持低成本了。我认为人们已经过度的夸张了在良好的安全性监控下进行生产可能节约的潜在成本。因此我觉得为户外种植遗传修饰过的作物颁发执照的可能性是微乎其微的。”
虽然还有法规和安全性的议题有待解决，分子农业依然能够使发达和发展中国家都受益良多。两年前，欧盟为Pharma-Planta计划提供资助（www.pharma-planta.org）。Pharma-Planta的科学家们已经签署了一份“人道主义的使用意向声明”，在声明中他们表明研究的目的是要生产用于解决发展中国家的贫困人口的健康需求的产品。今年，比尔及梅林达-盖茨基金会发起了名为“全球健康大挑战”（The Grand Challenges in Global Health）计划，并设立了由医学专家组成的委员会。专家们认为无针注射系统以及耐热性制剂是目前最迫切需要解决的问题。而分子农业则可能为克服制品在发展中国家进行储存、运输和投递过程中的障碍提供解决途径。发展中国家能够制造适合本国的疫苗植物并推广它们。“疫苗仿佛就是为植物制药业量身定做的，”Reichert评价道。在原始的非洲地区，利用可食用的植物来生产和投放疫苗看起来就像在梦想中预防疾病的科幻小说一样。但是在西方国家，疫苗仅仅是医疗市场中的一百种选择之一，因此对于生物技术公司而言，试图涉足这一领域是不可能离开公众或者非盈利性基金的支持的。
“我认为这个市场中确实存在着一些特殊的机遇。它们能补充或者可能满足一部分未被满足的要求，比如在发展中国家进行生产，”Reichert说道，“但我不认为在将来它们能够完全的取代那些传统生产的基础，如大肠杆菌和CHO细胞系。直到它们在生产那些产品时具有效率上的主导优势。”Mayer提到，《基因观察》认为人们不应该使用通常作为食物的植物作为制药作物。“那将是自找麻烦。我们确认污染是严肃的问题，一旦实验进入户外种植阶段，就必须对于可能存在的负面性环境效应给予足够的重视。”
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