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感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-21 　本站论坛

（适用于Stratagene和Novagen化学法制备的感受态细胞）

1、在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管。1支用来转化样品，1支做pUC18对照。同时将NZY+ broth培养基在42°C预热。
2、冰上融化感受态细胞。融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管。
3、每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME（巯基乙醇）。
4、温和转动试管，将细胞在冰上放置10分钟，每2分钟温和转动一下。
5、每管细胞加入0.1–50 ng样品DNA (或2 ml连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明。)用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA，并取1 ml稀释的pUC18 DNA加入转化细胞。
6、温和转动试管，并在冰上放置30分钟。
7、试管在42°C水浴热激30秒。热激时间对转化效率极度重要。
8、试管冰浴2 分钟。
9、每管加入0.9 ml 预热 (42°C) 的NZY+ 肉汤，37°C、225–250 rpm 摇床培养1 小时。.
10、取 ?200 ml转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB琼脂糖平板（如果进行颜色筛选还需加入IPTG和X-gal）。pUC18阳性对照则取5 ml 铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板。注意：细胞经 1000 rpm离心 10分钟会聚集，应将细胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉汤重悬。如果用于铺板的细胞 <100 ml，先将细胞加入200 ml培养基中，然后用灭菌涂布棒铺板。如果采用?100 ml细胞则可以直接铺板。倾斜涂布棒并轻轻拍打，尽量减少涂布棒上的细胞残留。
11、 37°C培养过夜。颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南。
12、 pUC18阳性对照预计有约250个克隆（?5 × 109 cfu/mg pUC18 DNA）。而样品DNA的转化效率随DNA的量和组成（超螺旋或连接产物）有较大差异，大质粒和非超螺旋DNA往往得到较少的克隆。

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·转化要点及疑难解析
·DNA的转化
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