方法二：
本法效率极高,建议大家采纳.
实验步骤：1、 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。
2、 挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率。
3、 在18度 150-250RPM 培养19-50小时。没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度。
4、 OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟。
5、 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体。
6、 去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟。
7、 再次离心回收菌体。
8、 用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上。
9、 在液氮或-80度保存。
10、 将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。
11、 挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。
12、 当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
13、 用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
14、 重复第4步操作。
15、 用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
16、 冰浴10min后，分装保存于液氮中。
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