方法一： 效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
实验试剂：
A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；
C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
实验步骤：1、 划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时。
2、 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时。
3、 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多。
4、 每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。
5、 加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
6、 用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。
7、 取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
注意事项：1、 洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
2、 离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
3、 涂板不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
4、 涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
5、 预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。
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