| 肠杆菌电转化感受态细胞制备经验过程 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-21 本站论坛 |
|  | 实验步骤：
1、 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 。
2、 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用 。
3、 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 。
4、 37°C下剧烈振荡培养2-6小时。
5、 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） ，当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）。
7、 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。
8、 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 。
10、 离心，弃上清液 。 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存。
转化方法:
1、 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 。
2、 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。
3、 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 。
5、 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。
6、 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 。
8、 转移细胞至适当的选择培养基上培养 。
上一篇：感受态细胞常用的制备方法 下一篇：高效感受态细胞制备 | | |
|
|
|
