感受态细胞常用的制备方法
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  • 感受态细胞常用的制备方法

  • 点击:    作者:   来源:基因酷 日期:2007-10-21    本站论坛

    常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
       转化,是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。?
  α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补( α-互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-?-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。


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