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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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2.将上述PCR反应混合物混匀放入PCR仪中。

3.PCR产物鉴定：取10μl PCR产物加2μl上样缓冲液，1%琼脂糖电泳。

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聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-08-29 　本站论坛

聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，从而免除基因重组和分子等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。
PCR进行的基本条件是：
（1）以 DNA为模板（在RT－PCR中模板是RNA）；
（2）以寡核苷酸为引物；
（3）需要4种dNTP作为底物；
（4）有 Taq DNA聚合酶。
PCR每一个循环由三个步骤组成：
（1）变性　　加热模板DNA，使其解离成单链；
（2）退火　　降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA所需扩增序列结合；
（3）延伸　　在适宜温度下，Taq DNA聚合酶利用dNTP使引物端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35个循环后，目标DNA 片段可能性扩增可达2³⁵倍。
PCR的影响因素：
（1）模板单、双链DNA或RNA都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。为提高PCR反应的特异性，所加DNA模板量应作相应的调整，如DN A（ng），染色体DNA（μg），待扩增片段（10⁴拷贝数量）来作起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA的蛋白质。
（2）引物引物是决定PCR结果的关键。引物的设计应遵循以下原则：
①引物的长度一般为18-25个碱基
②G+C含量一般为40-60%
③碱基的随机分布
（3）反应温度和时间　 PCR涉及变性、退火、延伸三个不同温度和时间。通常变性温度和时间为95℃，45秒至1分钟，过高温度或持续时间过长会降低TaqDNA聚合酶活性和破坏dNTP分子。退火温度可选择比变性温度（Tm ）低2-3℃，变性温度按Tm =4（G+C）%+2（A+T）%计算。在Tm 值允许的范围内，较高的退火温度有利于提高PCR特异性，退火时间一般为0.5-1分钟。延伸温度为72℃，时间与待扩增片段长度有关，一般1Kb 以内片段延伸时间为1分钟，如扩增片段较长可适当增加时间。
（4）Taq DNA聚合酶目前有两种Taq DNA聚合酶供应：从噬热水生菌中提取的天然酶和大肠杆菌表达的重组TaqDNA聚合酶（Ampli TaqTM ）。两种酶都有5’-3’外切酶活性，但均缺乏3’-5’外切酶活性。在PCR中，它们可以相互替代，催化典型的PCR所需酶量为l～2.5单位。酶量偏少则PCR产物相应减少，酶量过高则会增加非特异性反应。
（5）dNTP浓度 dNTP在饱和浓度（200 μmol／L）下使用。由于 dNTP溶液有较强酸性，配制时可用 l mol／L NaOH溶液将其贮存液（50 mmol／L）的 pH调至 7.0～7. 5。分装小管于-20℃保存。过多冻融会使其降解。（6）PCR缓冲溶液在反应体系中二价阳离子的存在至关重要，镁离子优于锰离子，而钙离子无效。它对引物与模板的结合、产物特异性、错配率、引物二聚体的生成及酶的活性等方面有较大影响，镁离子浓度一般在 0. 5～2. 5 mmol／L之间。每当首次使用靶序列和引物的一种新组合时，尤其要调整Mg⁺²浓度至最佳。
本实验从小鼠肝脏中提取的DNA中扩增β-actin基因，其片段长度为800 bp。

PCR扩增仪、掌式离心机、0.5ml PCR 管

1．PCR扩增试剂盒
2．引物1：5ˊATCTGGCACCACACCTTCTACAATG 3ˊ
引物2：5ˊCGTCACACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC 3ˊ
3．标准DNA：DL 2000

1.在0.5ml PCR塑料管中加入下列物质，并混匀。

10×PCR buffer(free Mg ⁺²)

5μl

25mmol /L MgCl₂dNTP

3μl
4μl

引物1

0.5μl

引物2

0.5μl

Taq(5U/μl)

0.25μl

模板(DNA< 0.1μg )

5μl

ddH₂O
总体积

31.75μl
50μl

3．PCR循环： 94℃

5 min

1个循环

94℃

45 Sec

55℃
72℃

45 Sec45 Sec

30个循环

　 72℃

7 min

延伸