大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化
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大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

点击:   作者:   来源:  时间: 2007-05-05  本站论坛
1.感受态的制备
  (1)接种单菌落于2ml LB培养液中, 37℃过夜。
  (2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中,37℃振摇4~6h至A590=0.4~0.6。
  (3)倒入50ml管内,水浴10min,以2500~3000rpm离心5min,弃上清。
  (4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体,冰浴20min,同上离心弃上清。
  (5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。
  2.重组DNA的转化
  (1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记:
  (2)冰浴30min至1h。中间摇动3次,以防受体菌沉底。
  (3)42℃90s。
  (4)37℃水浴5min。
  (5)加入无相应抗生素的Lb 200μl,混匀后,37℃水浴30~60min。
  (6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。


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