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大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-05-05 　本站论坛

1．感受态的制备
　　（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。
　　（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
　　（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
　　（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
　　（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
　　2．重组DNA的转化
　　（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记：
　　（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。
　　（3）42℃90s。
　　（4）37℃水浴5min。
　　（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
　　（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

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