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一步法制备感受态

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-05-05 　本站论坛

TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）
一、准备工作
1、缓冲液1×TSS的配制：
事先配制1M的氯化镁——20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。
取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。
2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种——Dh5α，用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶，分别装有30 ml和50mlLB，灭菌后置于4℃冰箱备用。
3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种。其余做转化用。

二、感受态制备程序：
1、前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养（12-16h）,按1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50 ml LB培养液中，于37 ℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40～50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。加入原体积十分之一（这里为5 ml）的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100 ul/份，全部冰上操作，－80度保存。

三、转化时取一管（100 ul）感受态细菌，（冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5ul DNA（0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液，37度150r/min温和振荡培养60min，涂布，室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。

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