农杆菌感受态细胞的制备和转化子的验证

一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。

取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH₂PO₄ , 10 g/L Mannitol, 2 g/L L-Glutamine, 0.2 g/L NaCL, 0.2 g/L MgSO₄, 0.3 g/L Yeast extract, PH7.0）液体培养基中，220rpm，28℃振荡培养18 hr左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃,220rpm,振荡培养至OD₆₀₀=0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min,去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200µl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。

二． 双元载体转化农杆菌EHA105

取1µg左右的质粒DNA加入到200µl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800µl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。

三．杆菌转化子的鉴定

A．农杆菌转化子的PCR鉴定

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50µg/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCR。PCR反应体系如下：

反应组分                 体积         终浓度        母液浓度

农杆菌转化子菌液    2µl                                    

P1 (35S)                    2µl          200nM          2µM

P2 (GUS)                   2µl          200nM          2µM

10×PCR Buffer        2µl                                      

Mg²⁺                          1.2µl        1.5mM         25mM

d NTP                       1.2µl          150µM         2.5mM

Taq酶                        0.2µl            1U             5U/µl

H₂O                           9.4µl

PCR反应参数设置如下：94℃预变性3min 后开始以下循环反应：94℃变性30秒，50℃退火1min ，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，取10µl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。

B．农杆菌转化子的酶切鉴定

提取农杆菌质粒DNA（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。

NA