TA克隆常见问题分析及其解决方案
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TA克隆常见问题分析及其解决方案

点击：   作者：51protocol收集   来源：  时间： 2007-03-08 　本站论坛
转化后无克隆菌产生 转化过程有问题或感受态细胞失活 可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确
插入对照DNA片段的阳性率低
10×快速连接缓冲
液稀释不当 提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液
连接反应存在问题 连接缓冲液只有低的活性。10×快速连接缓冲液含有ATP，温度波动ATP 易降解。使用一次性分装的缓冲液，避免其反复冻化
通过凝胶比较连接的和未连接的DNA 片段并检查分子量标准DNA 片段是否被连接成高分子量的片段，用大约20ng DNA 分子量标准（如Lambda DNA/Hind III 分子量标准）建立一个连接反应以检测连接酶及缓冲液的活力
T 突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数 避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。只使用无外源核酸酶的T4 连接酶
插入克隆片段与插入对照DNA相比，白色菌落的比例低。 如果使用的感受态细胞的转化效率很高（ ≥1 × 109 cfu/

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