| 重组DNA的转化实验 | | 点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-03-08 本站论坛 |
|  | 实验目的
制备出感受态细胞，把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
实验原理
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。pUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal培养基生长时，会产生白色的克隆，不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。
实验操作
（一）受体菌的培养与CaCl2处理（无菌操作）
1、取0.3ml种子液接到装有30 ml LB液体培养基的三用瓶中，振荡培养2-2.5小时
2、取出一定量菌液置于冰浴10分钟
3、4,000rpm，4℃离心5分钟，收集菌体
4、把菌体悬浮在4 ml 100mM冷CaCl2中，冰浴25分钟。
5、5,000rpm，4℃离心5分钟，收集菌体
6、再把菌体悬浮在1ml 100 mM冷CaCl2中置4 ℃ 12-24小时，备用。
（二）倒皿铺平板
1、按照各组转化反应的混合物
控制不同的选择性培养基(20 ml/皿)
LB固体培养基(100 ml) Amp（60μg/ml） Tet(40μg/ml)供连接混合物转化，pUC18转化用, 共5皿
LB固体培养基 (100 ml) Amp (60μg/ml) X-gal (40μg/ml) IPTG(24μg/ml),供连接混合物转化，pUC18转化用,共5皿
2、转化反应前一天，先铺好平板
3、取各组反应物在平板上涂布
4、培养皿倒置于37℃培养箱中过夜
5、观察转化子出现的情况
(三) 转化反应
待转化DNA的准备
我们需将连接混合物，提取的pUC18两种样品作转化反应，按下表准备
取上述两组混合物在Eppendorf管中，按如下处理：
1、将各组Eppendorf管置冰浴/小时以上
2、把上述样品置42℃水浴中，2分钟
3、转移到37℃水浴中5分钟，加800μl LB液体培养基
4、在37℃摇床上振荡培养1小时，取25μl涂皿
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