实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。 实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆载体为PUC18。 实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 实验步骤： 1．载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切： （50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）： DNA 30 ml R.E 1 ml 10×buffer 5 ml ddH2O 14 ml 37℃反应1hr，分别取8 ml 外源片段酶切产物和5 ml PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA 2．加入ddH2O 150 ml （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10 min； 3．吸取上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上； 4．12000g 4℃冷冻离心15分钟； 5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）； 6．按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50℃反应30 min 以上 DNA 20 ml CIAP（TaKaRa） 0.5 ml 10
