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功能基因cDNA 5’末端的克隆

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-03-08 　本站论坛

一．原理

⑴ 5’-RACE法

① 以目的mRNA 为模板，使用5’末端P 标记的RT 引物进行反转录反应，合成1ststrand cDNA。

② 使用RNase H 分解 Hybrid DNA-RNA中的RNA链。

③ 使用T4 RNA Ligase 使单链cDNA进行环化或形成首尾连接物。

④ 进行PCR扩增。

图 4－2 5’-RACE 法原理

⑵ 引物设计

二．材料与方法
1 材料
肝脏RNA
2 仪器、用具
PCR仪、0.2ml PCR管、移液器
3 试剂
(1) RNase Free H2O；10×RT PCR Bμffer (含dNTP Mixture)；RNase Inhibitor(40U/μl)；AMV Reverse Transcriptase XL (5U/μl)；RNase H (60U/μl)；5×Hybrid RNA Degradation Buffer；5×RNA (ssDNA) Ligation Buffer；T4 RNALigase； 40% PEG#6000
(2) ddH2O；10×PCR Buffe；MgCl2 (25mM)；3 sites Adaptor Primer (20μM)；TaKaRa Taq 酶
(3) TE
(4) 无水乙醇（预冷）
4 方法
(1) 1st strand cDNA 的合成

② 反转录条件为：30℃ 10min；50℃
2) Hybrid RNA的分解
① 按下列组成配制RNA分解反应液：

② 上述反应液中加入1μl 的RNase H，30℃反应1h。
③ 上述反应液加入100μl ddH2O，500μl 冰冷的无水乙醇。
④ 混匀，-20℃放置30min，进行乙醇沉淀。
⑤ 14000rpm 离心10min，弃上清。
⑥ 加入500μl的70%乙醇。
⑦ 14000rpm 离心5min，弃上清，干燥沉淀。
(3) 单链cDNA 环化（连接反应）
① 按下列组分配制连接反应液：

② 在上述沉淀中加入20μ 连接反应液，溶解DNA。

③ 加入20μl 40% PEG#6000，均匀混合。

④ 加入1μl T4 RNA Ligase，16℃过夜反应（15-18h）。

⑤ 连接反应结束后，将连接液用TE Buffer 稀释10 倍，-20℃保存备用。

(4) PCR 反应

① 1st PCR 反应

a. 反应体系：

b．按以下条件进行反应：PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行25 个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min ，55℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。
② 2nd PCR 反应
a．反应体系：

b．按以下条件进行PCR 反应：PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min，60℃退火1min，72 ℃ 延伸1 min；循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。
c．反应结束后，取 PCR 反应液（5-10μl）进行琼脂糖凝胶电泳。
(5) 将2nd PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳片段克隆到pMD-18T 载体，进行鉴定和序列分析（方法同实验六、实验七）。
(6) 获得cDNA 5’末端序列后，将其与cDNA 的核心片断及3’末端序进行拼接。这就获得了cDNA的全序列。

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