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实验步骤 |
实验原理 |
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1 双酶切（单位：μL） |
管 核酸 buffer ddH2O Hind III BamH I
1 15(AKP) 2 0 2 1
2 10(质粒)2 5 2 1
37℃酶解3小时 |
在此体系中，我们用Hind III 和BamH I这两种限制性内切酶来切目的基因，这样会产生两个不同的粘性末端，这时候如果插入目的基因，可以保证目标序列插入的方向并提高效率。
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2 酶切产物的纯化和回收
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1)
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向酶切体系的管中加入60 uL 溶液A（6mol/L NaClO4, 0.03mol/L NaAc，pH 5.2）和 15 uL溶液B(3mol/L NaAC, pH 5.2)，充分混匀。 |
高盐上样。
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2)
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将溶液置于离心柱中，静置5min。
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这是一个类似于吸附层析的过程。DNA会特异的吸附于硅质的薄膜上，故可以起到分离的效果。
高盐能促进吸附。 |
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3) |
8,000 rpm，离心30秒，弃液体。 |
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4)
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加入500 uL溶液C(用时一定按照 1：2 的比例加入无水乙醇，混匀后使用)于离心柱中， 8,000 rpm，离心30秒,弃液体。 |
此步骤是洗涤。
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5) |
重复步骤4。 |
再次洗涤。 |
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6) |
12,000 rpm，再离心60秒，去残余的乙醇。 |
将剩余的乙醇尽量完全甩出去。 |
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7) |
超净台中凉干。 |
挥发乙醇。 |
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8)
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加入25uL 溶液D(TE) ，500C 保温5min。
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此步骤是解析。
让DNA释放到溶液中，离心的方法可以将DNA纯化。
低盐有利于解吸附。 |
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9) |
12,000 rpm离心2min，管底溶液即为所需的DNA。 |
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10)
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1％琼脂糖，0.5 x TBE ,5 uL 样品，80V 恒压电泳，检测AKP和载体的相对浓度。
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为了使质粒和目标基因浓度比例在1:3到1:10之间，所以先用电泳的方法预先了解一下样品的浓度，然后再连接。
当质粒与目标基因比例合适时，可以由高的连接率，有效降低自连的发生。另外，酶的浓度过高还会有星号活力。 |
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3连接（单位：μL）
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AKP 质粒 buffer ddH2O T4DNA连接酶
15 2 2 0 1
14℃连接过夜，之后－20℃保存，用于转化受体细胞。 |
由电泳结果显示，我的质粒切得并不好，所以我用了本组另一名同学的质粒。他的质粒浓度高且纯净，所以用2μL就足够。我总共用20μL体系。
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4目的基因转化及筛选
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将连接好的质粒转入菌NovaBlue中（两个阴性对照），具体方法见试验一报告。
培养NovaBlue要用1/1000的Tet。
在预制的LB琼脂平板上，加40uL Xgal（20mg/mL ）和40uL IPTG（20mg/mL）溶液，均匀涂布于琼脂平板表面。
将复苏后的菌液离心，抽出0.8mL上清，剩余的细胞和上清液混匀，取100uL细胞悬液涂布在上述含Tet,Carb抗生素的培养皿中，平板向上静置30min,倒置培养过夜。 |
因为NovaBlue中含有f’质粒，它是抗Tet的，加入1/1000的Tet可以提供一个竞争压力，才能使这个质粒不丢失，这个菌株才能在有Tet的培养基中生长。
NovaBlue编码Tet诱发的promoter的RNA polymerase，培养基中有Tet,而petBlue中的Tet诱发的promoter可以按其启动方向转录出lacZα肽，NovaBlue中又含有lacω肽。这样就可以用互补α筛选出重组菌。
Xgal和IPTG较贵，只涂在培养基的表面，可以节省成本。
之所以将复苏后的菌液离心，抽出0.8mL上清，剩余的细胞和上清液混匀，取100uL细胞悬液涂布是因为重组成功的菌数量是很少的，这样可以增加平板上的菌的数量，有利于筛选出我们要的重组子。 |
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5重组子的筛选
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1）
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质粒DNA提取
方法同实验二
挑取重组子是要挑取蓝斑周围的白斑
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很多白斑的产生都是因为Xgal或IPTG之一没有涂均匀，而蓝斑周围的白斑很可能是因为重组子造成的，这样是假阳性的几率会比较小。
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2）
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酶切（37℃，1h）
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重组质粒
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buffer
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ddH2O
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4μL
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1μL
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2μL
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BamHI
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HandIII
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2μL
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1μL
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酶切结果可以分析是否是真阳性。
具体分析见电泳结果分析
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3）
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电泳分析重组质粒
1％琼脂糖，0.5xTBE, 80V恒压电泳
未酶切质粒（用未重组的质粒作为Marker）
3uL质粒 ＋ 0.5 uL 10 x loading 0.5 uL SYBR
酶切质粒（用标准DNA分子作为Marker）
8 uL质粒 ＋ 1 uL 10 x loading 1 uL SYBR |
电泳跑两排，前面的跑切过质粒，后面的跑没切过的质粒。因为没有被切过质粒分子量大，跑得慢，所以这样就不会追上前面的，这样可以电泳更长的时间，增大分辨率。
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4）
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重组子转化表达菌株
取电泳检验过得真阳性菌提出的质粒做感受态（菌用DE3placI），复苏后涂平板，平板上要加葡萄糖和Cam,Carb。
overnight |
葡萄糖可以抑制lacI本底表达。
DE3placI是含有T7RNA polymerase，而petBlue含有T7promoter，这个方向的转录可以才可以按正确的顺序表达目的蛋白。
DE3placI有Cam的抗性基因。Cam既可以稳定petBlue的f1区，也可以竞争抑制杂菌。 |
