热失活是终止酶切反应的一种简便易行的方法。大多数最适反应温度是37℃的酶在65℃下温育20分钟即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如将温度升高至80℃，温育20分钟也可失活。下表注明了每种酶的失活条件。
在50μl的反应体系中，37℃条件下，以0.5μg小牛胸腺DNA作为底物，加入5-10μl内切酶及相应缓冲液，反应60分钟，然后升温至65℃或80℃温育20分钟进行热失活。在上述混合液中加入0.5μg底物DNA（通常为λDNA），调节温度至最适反应温度，温育60分钟。若琼脂糖电泳显示底物部分或完全被消化，则表明该酶没有完全被热失活。
Enzyme
Heat Inactivation (temperature)
Aat II
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
No
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
No
Bae I
Yes (65°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
No
No
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
No
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
No
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
No
No
No
No
No
Yes (65°C)
Yes (80°C)
No
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Cac8 I
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Dde I
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Eae I
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Fat I
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Hae II
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Kas I
Yes (65°C)
No
Mbo I
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
Nae I
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Pac I
Yes (65°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (80°C)
No
Rsa I
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Sac I
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
No
Yes (80°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Taq I
Yes (80°C)
No
No
No
No
No
No
No
Xba I
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Yes (65°C)
Zra I
Yes (80°C)
