初筛得到的基因通常选用二级分析模型进行功能验证,验证方法可能通量略低,但与功能的相关性更强[15 ] 。
4 、反义核酸技术
反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) ,可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达,用来快速、有效地测定基因功能[16～18 ] 。
4. 1 RNA 干扰技术
天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内, 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋, 对基因功能起重要的调节作用。RNA 干扰技术(RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义RNA 与正链RNA 形成双链RNA ,特异性抑制靶基因转录后表达这一原理,成为研究转录后调控的有效工具, 广泛用于功能基因组学、基因治疗和转录调控机制研究[16～18 ] 。在这一技术中,早期使用双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂,核心技术是小分子干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成(哺乳动物通常选择21～23 bp dsRNA ,其他生物选择更长的片段) ,另外,还包括siRNA 的标记、转染和RNAi 的检测。
然而,基因敲除实验显示RNAi 存在一定程度的非特异性[19 ] 。分析认为,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功,部分是由于所使用的短链dsRNA 激活了胞内dsRNA 依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积[20 ] 。新近两方面技术的发展使得RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效: (1) 使用能使siRNA 稳定表达的新的载体系统[21 ] ; (2) 利用人U6核内小RNA ( snRNA) 启动子进行单一RNA 转录单位的核内表达[22 ] 。即通过转染dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约20 bp 的dsRNA ,后者通过RNA依赖的RNA 合成酶复制,并结合到核酸酶复合物上,形成RNA 诱导的转录沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) ,降解靶mRNA[17 ] 。
4. 2 反义寡核苷酸
反义寡核苷酸主要通过RNase H介导的机制抑制基因表达。RNase H 是一种降解RNA2DNA 杂交链中RNA 的酶,产生5′-磷酸和3′-OH 端。RNase H酶切产物因缺少5′-cap 和3′-poly A 尾而被细胞中的5′和3′外切酶降解。这种高效的方法已被广泛用于含有反义寡核苷酸序列样的靶基因的下调( down regulation) 。实际上,这种技术对于鉴定mRNA 中的有效靶基因在某种程度上靠经验,因为许多靶基因不能显示最佳活性。可以通过增加反义寡核苷酸的种类克服这种局限,如在96 孔板上进行PCR 后, 同时使用80 种以上的反义寡核苷酸进行同一个mRNA表达的研究。整个过程仅用4～5 d。因此,这是一种高通量的基因功能检定方法[16 ] 。化学修饰如2′-甲氧基乙基化〔2′- O-(2-methoxy) ethyl ,2′-MOE〕可降低细胞中核酸酶对寡核苷酸的降解作用,因而得到越来越多的研究应用[23 ] 。反义寡核苷酸技术已被用于多种系统的基因功能研究,如蛋白磷酸化酶、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂p27/ kip (cyclin-dependent kinase inhibitor p27/ kip) 、凋亡蛋白抑制剂survivin 和抗凋亡蛋白BCL-XL[16 ] 。反义技术广泛用于体内外模型中靶基因功能的验证,可部分替代基因敲除技术。
5、转基因/ 基因敲除技术
应用于基因转染细胞和转基因动物的转基因技术,连同基因敲除技术,已经成为基因功能评价和功能确证的有力手段。
5. 1 基因转染技术
真核细胞的基因转染(gene transfer) 是研究基因功能的有效手段之一。转染基因包括质粒DNA , RNA 和寡核苷酸。转染分为瞬时转染(DNA 导入宿主细胞的核中但不整合到染色体中) 和稳定转染(DNA 整合到宿主细胞的染色体中或形成附加体) ,可通过物理(如电穿孔法) 、化学(如磷酸钙、阳离子脂质体、非脂质体脂类) 和生物学方法(如逆转录病毒等病毒介导的) 进行,常用转染方法见表1。其中,非脂质体脂类转染试剂,如FuGene 6 , 由于对一些细胞的毒性比一般阳离子脂质体的要小,可提高转染效率和扩大使用细胞的范围,因此在一定程度上受到欢迎[24 ] 。转染条件的优化包括培养细胞的密度、核酸量、核酸与转染试剂的比例、转染时间、转染后培养时间等。影响转染的主要因素有细胞培养物(如细胞代次、培养基、血清等) 、载体大小及形式(超螺旋或线性) 、核酸质量(纯度、内毒素含量) 及转染方法。
基因转染细胞越来越多地用于基因功能的发现和验证,也可用来对目的基因及其表达产物进行细胞内定位研究,以验证该基因是否编码结构蛋白, 或表达分泌蛋白[25 ] 。
表1 常用的转染方法
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