然而亲合素（Avidin）有许多局限性：
a 由于它的等电点（PI）是10，所以在pH接近中性时，带强正电荷，因而可与核酸或磷脂类等阴电荷分子以一种非特异方式结合。如作核酸原位杂交时，可产生非特异染色；
b 由于亲合素是一种糖蛋白，可通过糖链部分与凝集素类生物分子起反应。这些非特异性反应妨碍了亲合素的广泛使用。为了克服上述缺点，采用了一些措施，如设法降低亲合素的高等电点（PI）。例如，并这种修饰后的亲合素仍含有糖链，难以降低背景染色。因此，有人索性放弃使用Avidin而改用抗生物素抗体与生物素发生连结反应。
从链霉菌（Streptomyces Avidini）中提取一个分子量为60kD的蛋白Streptavidin，可取代前面所讲的Avidin。它同样是有四个与生物素高亲和合结合位点而不含糖链，其等电点为6，与中性pH接近，在生理pH或轻度碱性pH下仅带微量电荷。因此Streptavidin比Avidin更有实用前景，特别在核酸杂交技术中，运用胶体金标记的Streptavidin可以使原位杂交技术深入到电镜水平。生物素类标记探针进行分子杂交时，为避免产生高本底，可在操作中进行一些改进仍可以达到低背景。如在杂交液中加入一定量的牛血清白蛋白、甘氨酸或硫酸葡聚糖欠盐等。另外，增加封闭时间（最好过夜）也会和到一定作用。
光敏地高辛标记核酸探针，操作方便、灵敏度高，已标记的探针在4℃贮存可达两年之久，方便随时应用。用光标记法将光敏Dig标记到探针上，制成光敏-Dig-核酸探针，再与固定在硝酸膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交，使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合，最后可用不同的检测方式进行检测，发光检测和显色检测均可，灵敏度可达0.1-1pg.用光敏地高辛标记探针,可以避免组织中(尤其是原位杂交)内源性生物素引起的假阳性问题或使本底增高的麻烦.
2 半抗原检测
检测半抗原标记探针的方法,是先使探针与抗半原抗体(第一抗体)结合,再与酶连接特异抗抗体(二抗)结合.探针与两个抗体之间的反应时间一定要控制好,时间过长、过短均会影响信号的强弱.最后仍用显色法检测探针杂交的结果.
3 两步比色法检测
生物素标记探针,与检测系统的链亲合素和生物素碱磷酶两步结合法进行检测,这样可以减轻本底,但又增加了操作的难度.
4 化学发光检测
化学发光检测也是近年来发展起来的检测手段,它需要一定的发光增强剂,并配有各自的过氧化物酶系统。主要是生物素探针与固定在硝酸膜（或尼龙膜）上的DNA结合，生物素与亲合素，过氧化物酶（或碱磷酶）结合，再经过化学发光及增强作用，将光量放大后，在X片上发光自显影，将特异结合的DNA区带显示出来。化学发光检测敏感性高，但需要在暗室进行X光片曝光，并且操作要速度，时间要掌握适度，这样就增加了操作难度（见表3）。
表3 分子杂交的显示系统
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标 记 物 |
杂交体的检测方法 |
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同位不比或放射性分子
生物素类
酶类
荧光素
半抗原
稀有金属(Eu3 、Ag、Hg等)
重金属 |
放射自显影式计数
酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色
直接底物显色或用酶标体加底物显色或加发光底物自显影
直接荧光镜检或酶标体加底物显色
酶标抗体加底物显色
时间分辨荧光
电子密度标记电镜观察，适于细胞原位杂交 |
四、核酸探针的应用
(一) 鉴定特异性目的基因及外源DNA的检测
在基因工程中，含有特异性目的基因的重组子，可通过核酸分子杂交进行鉴定。生物工程产品中残留的宿主细胞DNA是一种潜在的与工艺相关的杂质。各种产品中所含的残留DNA，取决于所用的突破主微生物（细菌或细胞）和生产该产品的回收工艺。例如：DNA或其降解片断，可以被阴离子交换剂（DEAE-Sepharose FF，Mono Q等）吸附，洗脱时混入到蛋白级分中。现虽还没有因使用含DNA的生物制品而影响人体健康的报道，但管理部门则要求生产者控制生物工程产品中的DNA含量，使之保持在低水平。我国卫生部制定了相应规定；美国药典、英国药典和世界卫生组织的文件均有相应的规程和方法；均要求每一剂量制品所含残留DNA的量不得大于100pg（10-12 g），但测定方法并无具体细节。国内有些单位已开展了此项工作。我们采用非同位素法，以长臂光敏生物素标记核酸探针，通过分子杂交检测残留DNA。方法的检测灵敏度为2pg，符合100pg/剂量的标准要求。
(二) 基因诊断方面的应用
以基因探针杂交和基因体外扩增两项技术为主干，以转印、电泳、限制性酶切乃至DNA测序、基因拼接等技术为辅助，使基因诊断逐步成长为一套有广泛用途的、高灵敏度（ag级）、高特异性（能查明一个核苷酸的差异）的医学生物学诊断手段，不同模式的基因诊断可以随需要而任意选用，例如：
(1) 斑点或条状杂交模式。适用于大批量标本的检测，如普查、献血员初筛等场合，每人每天的检测可以达到1000个标本以上，如果辅以半自动的样品处理、分子杂交仪等检测数则可增加数倍，对含多拷贝重复序列的疟原虫检测可达高灵敏度。
(2) 探针杂交模式将不可替代地用于原位杂交、菌落或细胞群落的转印杂交筛选，用于检测片段中的点突变（示并差杂交），用作探针来亲和（杂交）分离含互补序列的片段等。
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