【原理】
Southern印迹是将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
DNA分子经限制性核酸内切酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳将得DNA片段按分子量大小分离，然后将含DNA片段的琼脂糖凝胶变性，并将单链DNA片段转移到硝酸纤维素膜或其它固相支持物上，而各DNA片段的相对位置保持不变，这种滤膜可用于杂交反应。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。
【操作】
(1)取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1～0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因顺序，则需要10～20ug；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要多至30～50μg。酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳，在其中1孔中加入适当的DNA分子量标准参照物。电泳结束后，溴化乙锭(EB)染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1张保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA样品带的位置，在凝胶旁置1标尺照像。
(2)切除无用的凝胶部分。将凝胶的左下角切除，以便于定位，然后将凝胶置于一搪瓷盒中。
(3)将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放1小时使之变性，不间断地轻轻摇动，对于较大的DNA片段(如大于15kb)，可在变性前用0.2mol／L HCl预处理10分钟使其脱嘌呤后，再进行碱变性处理。
(4)将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30分钟，不间断地轻轻摇动。换新鲜中和液，继续浸泡15分钟。
(5)如图8-1所示，在一塑料或玻璃平台上铺一层Whatman 3mm滤纸，此平台要求比凝胶稍大。将此平台置于一搪瓷盒或玻璃缸中，搪瓷盒中盛满10×SSC。滤纸的两端要完全浸没在溶液中，将滤纸用20×SSC湿润，用一玻璃棒将滤纸推平，并排除滤纸与玻璃板之间的气泡。
(6)裁剪一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜。注意操作时要戴手套，千万不可用手触摸，否则油腻的膜将不能湿润，也不能结合DNA。
(7)将硝酸纤维素滤膜漂浮在去离子水中，使其从底部开始向上完全湿润。然后置于20×SSC中至少5分钟。注意滤膜如果不能被湿润则不能用。
(8)将浸泡好的凝胶上下颠倒后，置于上述铺了一层Whatman 3mm滤纸的平台中央。注意两者之间不要有气泡。
(9)在凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，以防止在转移过程中产生短路(转移液直接从容器中流向吸水纸而不是经过凝胶)，从而使转移率降低。
(10)将湿润的硝酸纤维膜小心覆盖在凝胶上，膜的一端与凝胶的加样孔对齐。排除两者之间的气泡。相应地将膜的左下角剪去。注意膜一经与凝胶接触即不可再移动，因为从接触的一刻起，DNA已开始转移。
(11)将两张预先用2×SSC湿润过的与硝酸纤维素膜在大小相同的Whatman 3mm滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，排除气泡。
(12)裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸，约5～8cm厚。将之置于Whatman 3mm滤纸之上。在吸水纸之上置一玻璃板，其上压一重约500g的物品，如图8-1所示。
(13)静置8～24小时使其充分转移，其间换吸水纸1~2次。
(14)弃去吸水纸和滤纸，将凝胶和硝酸纤维素膜置于1张干燥的滤纸上。用软铅笔或圆珠笔标明加样孔的位置。
(15)凝胶用溴化乙锭染色后紫外线下检查转移的效率。硝酸纤维素膜浸泡在6×SSC溶液中5分钟，以去除琼脂糖碎块。
(16)硝酸纤维素膜用滤纸吸干。然后置于两层干燥的滤纸中，真空下80℃烘烤2小时，此过程使DNA固定于硝酸纤维素膜上。
(17)此硝酸纤维膜即可用于下一步的杂交反应。如果不马上使用，可用铝箔包好，室温下置干燥处保存备用。
(18)如用于杂交，杂交方法见实验三十二。
【器材】
琼脂糖电泳装置：真空泵；真空烤箱；其它实验室常规仪器及试剂。
【试剂】
适当的限制性核酸内切酶
琼脂糖
变性液：1.5mol/LNaCl；0.5mol／L NaOH。
中和液：lmol／L Tris-Cl（pH8.0）；1.5mol／L NaCl。
转移液（20×SSC）：3mol／L NaCl；0.3mol／L柠檬酸钠，pH7.0。
硝酸纤维素膜或尼龙膜
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