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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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大白鼠肝DNA的提取与鉴定

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-07 　本站论坛

一、目的
掌握从动物组织中DNA基本原理和方法，了解利用电泳技术分离、鉴定核酸的原理和方法。

二、原理
真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于细胞核中，因此制备DNA必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使核蛋白释放，在除去蛋白质、脂类、糖类和RNA等物质，得到纯化的DNA。在本实验的提取DNA反应体系中，SDS（十二烷基磺酸钠）破坏细胞膜和核膜，并使蛋白质变性，将核蛋白中的DNA与蛋白质分开，EDTA及SDS抑制细胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法进一步除去蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀除净小分子化合物。提取出的DNA制品进一步用含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳加以鉴定。

三、材料
（一）仪器
研钵；研钵棒；刻度离心管；普通离心机；小试管；Ep管
（二）试剂
1、生理盐水
2、裂解缓冲液
3、苯酚：氯仿混合液（1：1）
4、无水乙醇
5、70％乙醇
6、TE缓冲液
7、溴酚蓝载样液
8、溴乙锭溶液
9、TBE缓冲液

四、操作步骤：
1、处死大白鼠，迅速取出大白鼠肝脏，用生理盐水洗去附着血液，用滤纸吸干血水后称量0.5g肝实质组织放于研钵中。
2、研钵中加入1ml裂解缓冲液、少量石英砂，研磨至匀浆，再加入2ml继续研磨至匀浆。
3、取刻度离心管一支，加肝匀浆至1.0ml，再加入等体积苯酚：氯仿混合液抽提，每次抽提以中等大小的力来回振荡5min，然后离心3000r/min，10min，水相吸入另一干净的小试管中，抽提重复3次『注1』。
4、往乘有上水相的小试管中加入2.5倍体积的冷无水乙醇，轻轻混匀，此时可见有白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。
5、将试管中的上清液倒出，保留沉淀。用70％的乙醇洗涤沉淀2次，洗涤时动作要轻柔，同上法弃上清保留沉淀『注2』。
6、加入0.25mlTE缓冲液溶解沉淀。
7、取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。
8、向Ep管中加入溴酚蓝载样液5ml，混匀后即为鉴定所用样品。
9、取琼脂糖0.3g，TBE缓冲液15ml加入锥形瓶中，加热锥形瓶使琼脂糖充分熔解后，加入10ml溴乙锭，混匀后将胶液倒入已放置样孔梳的胶板上。
10、待胶板凝好后拔去样孔梳，取15ml样品液加入样孔槽中。
11、将加好样品液的胶板放入乘有TBE缓冲液的电泳槽中，样孔槽位于阴极侧，盖好电泳槽盖后通电，调节电压100V电泳40-60min。
12、泳毕，拿出胶板，在紫外光灯下观察结果。
『注1』吸水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提3次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见，若变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数。实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。
『注2』最后一次弃上清时，尽可能去尽上清。

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