图1 四种方法得到的质粒DNA经sm a I单酶切后电泳图(1, 2, 3, 4: 分别用方法1, 2, 3, 4 所提取的质粒pB I121;M:DL15000Ma rke r)
2. 3 PCR扩增h IL - 12特异片段 四种方法提取的质粒DNA扩增h IL - 12,其基因片段大小为1613bp,方法4提到的质粒没有扩增出h IL - 12,说明此法所提取的质粒DNA含蛋白质较多,见图2。
图2 四种方法提取的质粒DNA PCR扩增结果电泳图(1, 2, 3, 4: 分别用方法1, 2, 3, 4 所提取的质粒pB I121;M:
DL2000Ma rke r)
3 讨论
碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2 和Mg2 螯和,抑制DNase的活性,溶液II裂解细菌,变性蛋白质和少量质粒,溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀,质粒DNA复性[ 4 ] 。因此如果实验中缺少了溶液Ⅰ,用LB 液体培养基代替之也可以,只要在短时间内完成质粒的提取即可。裂解细菌主要是溶液II中的NaOH, 而不是SDS,所以叫碱裂解法,若只用SDS也能抽提得到少量质粒,这是因为SDS也是碱性的,但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。另外, NaOH若不是新配制的,可能会由于空气中的CO2 与NaOH作用,减弱了其碱性。这一步操作要注意两点:一是,放置时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂[ 5 ] 。二是,混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。加入溶液Ⅲ后,会有大量的沉淀生成,这是由于要SDS与蛋白质结合后,
SDS与醋酸钾生成了PDS, PDS的溶解度要比SDS低的多,从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了。若用醋酸钠代替醋酸钾,所得到的沉淀就会大大减少[ 4 ] 。
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