* 若需长期保存RNA，可将乙醇沉淀形式的RNA 置-20℃保存。使用前按照步骤A12～A13 操作溶解RNA。
A12. 加50～200 μl Buffer TE 充分溶解RNA 沉淀，4℃，≥12000×g 离心2 min。
* 可根据RNA 沉积块大小和RNA 使用浓度来决定Buffer TE 的体积。
A13. 将上清转移到RNase-free 的离心管，置-20℃以下保存。
[B. 纯化基因组DNA]
B8. 在分离到的相间沉淀中加0.4 ml 65℃预热的Buffer G-A，用1 ml Tip 头快速吹打10 次或旋涡振荡15 sec，65℃温育5min。
B9. 加0.4 ml Buffer G-B，旋涡振荡15 sec。
B10. 加0.65 ml Buffer P2，用力混合均匀，12000×g 离心1 min。
* 离心后溶液分相，蛋白质沉淀在相间，DNA 被分配在下相。
B11. 将Filter 置于洁净的1.5 ml 离心管中。吸弃上相，将下相转入Filter，12000×g 离心1 min。
* 上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相,可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见第5 页图2）。
* 务必除尽上相，否则将抑制DNA 结合到silica 膜上。
* 如在转移过程中吸入少量相间沉淀，可在过滤时去除。
B12. 弃Filter，在滤液中加入0.45 ml Buffer B，混合均匀。
B13. 将DNA-prep Tube 置于2-ml Microfuge Tube 中，将步骤B12 中的混合液移入DNA-prep Tube 中，
2500×g 离心1 min。
* 如在DNA-prep Tube 中仍残留溶液，适当升高离心速度，再次离心，使所有溶液过滤到2-ml Microfuge Tube
中。
B14. 弃滤液，将DNA-prep Tube 置回2-ml Microfuge Tube 中，加入0.5 ml Buffer W1，2500×g 离心1 min。
* 如在DNA-prep Tube 中仍残留溶液，适当升高离心速度，再次离心，使所有溶液过滤到2-ml Microfuge Tube
中。
B15. 弃滤液，将DNA-prep Tube 置回2-ml Microfuge Tube 中，加入0.7 ml 已加无水乙醇的Buffer W2，2500×g 离心1 min。以同样的方法再用0.7 ml Buffer W2 洗涤一次。
* 确认在Buffer W2 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
B16. 将DNA-prep Tube 置于1.5 ml 离心管中，12000×g 离心1 min。
B17. 将DNA-prep Tube 置于另一洁净的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加入6 μl 65℃预热的Eluent
或去离子水，室温静置1 min。12000×g 离心1 min 洗脱DNA。
1. 收集样品。
2. 匀浆。
3. 补充Buffer R-A 至0.4 ml。
4. 加0.15 ml Buffer R-E。
5. 加0.45 ml Buffer R-B。
6. 加0.45 ml Buffer R-C。
A7. 分离0.8 ml 下相，加0.65 ml Buffer R-D 沉淀RNA。
A8. 加100 μl Buffer R-A 和100 μl RNase-free Water 溶解RNA。
A9. 加160 μl 异丙醇沉淀RNA。
A10. 加0.5 ml 50%乙醇洗涤沉淀。
A11. 加50～200 μl Buffer TE 溶解RNA。
B7. 分离相间沉淀，加0.4 ml Buffer G-A 溶解沉淀。
B8. 加0.4 ml Buffer G-B。
B9. 加0.65 ml Buffer P2。
 B10. 分离下相，转入Filter。
B11. 加0.45 ml Buffer B。
B12. 溶液转入DNA-prep Tube。
B13. 加0.5 ml Buffer W1 洗涤。
B14. 加0.7 ml Buffer W2 洗涤，重复Buffer W2 洗涤。
B15. 离心除尽乙醇。
B16. 加60 μl Eluent 或去离子水洗脱。
九、 常见问题分析
[纯化RNA 时的常见问题]
1. 无RNA 沉淀
（1）匀浆不完全：匀浆不完全时，基因组DNA 分子仍然很大，溶液粘稠。加入Buffer R-B 后，变性的蛋白质和基因组DNA 一起形成絮状凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地释放到溶液中。
（2）沉淀不完全：从小于≤2×105 动物细胞、≤2 mg 动物组织或RNA 含量低的样品中提取RNA 时，匀浆体积太大， 将造成RNA 过分稀释而不能有效地沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA 时，应按比例减少抽提溶液，在加Buffer R-D 后延长冰浴和离心时间，具体实验参数见相应操作步骤。
2. RNA 回收率偏低
（1）系统超负荷：如果过多增加单位体积内的样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA 和蛋白质所占比例增大，使RNA 不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致
相分离困难，降低RNA 沉淀效率。
（2）匀浆不完全：匀浆不完全时，RNA 分子易被蛋白质和基因组DNA 复合物包裹，不能被有效释放。
（3）沉淀未有效溶解：未完全溶解RNA 沉淀，未溶解的RNA 丢失。
（4）样品未及时处理或细胞生长过度：样品分离后短时间内细胞内RNA 酶被激活，细胞生长过度同样会激活细胞内RNA 酶，若不及时提取RNA，大部分RNA 会被降解。若样品暂时不作RNA 提取，应立即用液氮冷冻完全，置-80℃贮存。
3. RNA 难溶解
（1）相分离不完全：两次相分离过程均需在低温下进行，预冷抽提溶液、冰浴和4 ℃离心是必需的。另外，Buffer R-C 驱动的相分离过程中，长时间离心也是去除不溶性杂质必需的。
（2）Buffer R-C 驱动相分离后，吸取下相时带入不溶性沉淀物；这些不溶性物质在Buffer R-D 驱动的相分离过程中和RNA 一起沉淀下来，降低RNA 溶解性。
4. RNA 降解
（1）组织分离后未经液氮冷冻完全即进行总RNA 提取或贮存。
（2）液氮碾磨过程中未及时添加液氮，样品融化，细胞中释放的RNA 酶降解RNA。
（3）匀浆不充分：组织或细胞成分未完全分散，样品中RNA 酶未完全灭活。
（4）相间沉淀未弃尽：在加入Buffer R-D 进行相分离后，应弃尽液相和相间沉淀。否则，相间沉淀中残留的RNA 酶在溶解后导致RNA 的降解。
（5）Tip 头、离心管、贮存管受RNA 酶污染。
（6）RNA 在水溶液中呈酸性，易自发水解，所以RNA 应溶于Buffer TE 中，-20 ℃以下保存。
[纯化基因组DNA 时的常见问题]
1. 基因组DNA 降解
（1）样品不新鲜：虽然DNA 在分子结构上较RNA 稳定，但样品在分离后细胞内的DNA 酶同样会作用于DNA 分子。
（2）样品本身富含DNA 酶：处理这样的样品，宜用Buffer W1 洗涤两次。
2. 得率低或无基因组DNA
（1）DNA 未充分释放：在分离到的相间沉淀中加Buffer G-A 后未充分振荡释放DNA。
（2）Buffer W2 中未加入无水乙醇：未加乙醇的Buffer W2 是一种低盐溶液，可溶解DNA。若直接用于洗涤DNA-prep Tube 将会溶解并去除结合在silica 膜上的DNA。
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