| 总RNA和基因组DNA同步纯化试剂盒 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-06 本站论坛 |
|  |
[分离RNA 和基因组DNA]
1. 样品收集和匀浆
[动物细胞]
* 从对数生长期细胞中提取的RNA 和DNA 质量好、得率高，所以细胞密度不宜超过85%，最好在提取前一
天更换培养基。但有的基因在特定的生长状态或激活状态下达到最适表达，故实验所需的细胞状态还需根
据具体实验目的而定。
A. 悬浮培养的动物细胞或新鲜分离的动物组织单细胞悬液
* 从脾脏、淋巴结和胸腺等富含RNA 酶的组织中提取RNA 和DNA 时，宜用温和的方法将之分离成单细胞
悬液。
（1）取1×107 细胞，4℃，1200×g 离心5 min，弃尽上清。
（2）加0.45 ml 4℃预冷的Buffer R-A，立即用带4～6 号针头的1 ml 注射器反复吸注10 次。
* 匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不
连续滴状滴落，而非连续状。
B. 贴壁培养的动物细胞
（1）将含1×107 细胞的培养器皿置冰上，吸尽培养基。加5 ml 4℃预冷的PBS 或不含血清的培养基洗涤细胞，尽量吸尽洗涤液，并避免用力吹打细胞。
（2）加0.45 ml 4℃预冷的Buffer R-A，使之遍及细胞层，用细胞刮刀将匀浆收集到培养器皿一侧，吸取匀浆转入1.5 ml 离心管。
（3）用带4～6 号针头的1 ml 注射器反复吸注10 次。
* 匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不
连续滴状滴落，而非连续状。
[动物组织]
（1）动物组织分离后，立即置冰上剪切成0.5 cm 大小的组织块，浸入液氮中。
* 操作必须迅速，以防止RNA 在提取前降解；若暂时不作提取，冷冻完全后置-80℃冰箱中保存。
（2）称取100 mg 冷冻完全的组织块，放入研钵中，边碾磨边加液氮（防止样品融化），直至将样品碾磨成粉末状。
（3）加0.45 ml 4℃预冷的Buffer R-A，迅速用力碾磨至Buffer R-A 完全融化，继续碾磨30 sec。
（4）将匀浆转入1.5 ml 离心管。如匀浆残留较多，加100 μl Buffer R-A，适当研磨后，收集合并到1.5 ml 离心管。
（5）用带4～6 号针头的1 ml 注射器反复吸注10 次。
* 匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不
连续滴状滴落，而非连续状。
[酵母菌]
（1）取5×107 对数生长期酵母菌，10000×g 离心20 sec ，弃尽上清。
（2）破壁和匀浆
用户可选择酶法或碾磨法破坏细胞壁。酶法是用Lyticase 消化细胞壁，将酵母菌制成原生质体。
碾磨法是用机械力破坏细胞壁。两种方法在RNA 的纯度和得率上无任何差别。
A. 酶法
（a） 用1 ml 已加入70U Lyticase 的酵母菌原生质体制备缓冲液悬浮酵母菌沉淀，30℃温育10～30 min。
（b）4 ℃，3000×g 离心5 min，弃尽上清。
（c）加0.45 ml 4 ℃预冷的Buffer R-A，立即用带4～6 号针头的1 ml 注射器反复吸注10 次。
* 匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不
连续滴状滴落，而非连续状。
B. 碾磨法
（a）用100 μl 去离子水悬浮沉淀，转入研钵，加入液氮，待酵母菌冷冻完全后，快速用力碾磨1 min
（边加液氮边碾磨，防止样品融化）。
（b）加0.45 ml 4℃预冷的Buffer R-A，迅速用力碾磨至Buffer R-A 完全融化，继续碾磨30 sec。
（c）将匀浆转入1.5 ml 离心管，如有较多匀浆残留在研钵中，加100 μl Buffer R-A，适当匀浆后
收集合并到1.5 ml 离心管。
（d）用带4～6 号针头的1 ml 注射器反复吸注10 次。
* 匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不
连续滴状滴落，而非连续状。
2. 吸取0.4 ml 匀浆液转入另一1.5 ml 离心管中，若匀浆体积不足 0.4 ml，加Buffer R-A 补充至0.4 ml。
3. 加0.15 ml Buffer R-E，盖紧离心管，旋涡振荡混合均匀或或用步骤1 中使用的注射器反复吸注2～3次。
4. 加0.45 ml 4℃预冷的Buffer R-B，盖紧离心管，用力上下混合均匀。
5. 加0.45 ml 4℃预冷的Buffer R-C，盖紧离心管，用力上下混合均匀，冰浴5 min。
6. 4℃，≥12000×g 离心5 min。
* 离心后溶液分相：RNA 和游离DNA 位于下相；脂质、多糖和色素位于蓝色上相；蛋白质与基因组DNA
复合物形成相间沉淀；若起始样品是动物组织，可能有肉眼可见的不溶性物质沉淀在管底。
7. 吸取0.8 ml 下相溶液，转移至另一离心管中，按 [A. 纯化RNA]进行操作。吸弃原离心管中上相和下相溶液，保留相间沉淀，按 [B. 纯化基因组DNA]进行操作。
* 分离下相时勿吸取管底沉淀，偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见第4 页图1）。
[A. 纯化RNA]
A8. 在分离到的下相中加0.65 ml 4℃预冷的Buffer R-D，盖紧离心管，用力上下混合均匀，冰浴5 min。
* 若样品是≤2×105 细胞、≤2 mg 动物细胞或RNA 含量低的样品，在步骤A8 中冰浴10 min，在步骤A9 中离心时间延长至20～30 min。
* 分离的下相的体积与Buffer R-D 的体积比为16 : 13。
A9. 4℃，≥12000×g 离心10 min 将RNA 沉淀于管底。
* 离心后溶液分相：游离DNA 位于下相，残留的蛋白质变性析出形成相间沉淀，RNA 沉淀于离心管底。
A10. 倒置离心管稍用力甩弃或用Tip 头吸弃液相和相间沉淀；简短离心，仔细吸尽残余液体。
* 必须将液相和相间沉淀去除干净，否则会影响RNA 纯度。
* 吸走液相时，仔细观察RNA 沉淀，勿将RNA 沉淀吸走。
A11. RNA 沉淀洗涤
若提取的RNA 用于RT-PCR、Northern Blot、制备mRNA 和构建cDNA 文库，可省略步骤（1）和步骤（2），直接按照步骤（3），用50%乙醇简单洗涤RNA 沉积块。
（1）加100 μl Buffer R-A 和100 μl RNase-free Water，旋涡振荡或用Tip 头反复吹吸充分溶解沉淀。
（2）加160 μl 异丙醇，混合均匀，4℃，≥12000×g 离心5 min； 弃尽上清。
（3）加0.5 ml 4℃预冷的50% 乙醇， 倒置离心管丢弃液相；简短离心，仔细吸尽残余液体。置空气中将乙醇挥发除尽。
上一篇：微量DNA的纯化 下一篇：DNA末端修饰原理 共5页: 上一页 [1] [2] 3 [4] [5] 下一页 | | |
|
|
|
