表1. 各种培养器皿中密集生长的HeLa 细胞参考数量：
（2）动物组织：称取动物组织重量。
（3）酵母菌：培养液中细胞浓度可用分光光度计来检测：将培养液稀释至OD600 为0.05～0.3 之间，按0.1
OD600 相当于3×106 细胞/ml 的比例计算细胞浓度。比如，培养液稀释4 倍后OD600 为0.25，则该培养液的浓度为3×107 细胞/ml。
3. 决定起始样品大小
本试剂盒起始样品不能超过1×107 动物细胞、100 mg 动物组织或5×107 酵母菌，该限制主要来自以下两方面原因：
（1）系统最大负荷的限制：过多增加起始样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA 和蛋白质所占比例增大，使RNA 不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难，降低RNA 沉淀效率。
（2）DNA-prep Tube 最大结合能力的限制：DNA-prep Tube 中整合的silica 膜最多能结合30 μg DNA，剩余的DNA 因不能结合到silica 膜上而丢失。另外，若样品量太小，不影响提取DNA，但会造成RNA过分稀释而不能被有效地沉。此时，需按比例减少抽提溶液的体积，以提高沉淀RNA 的效率；请参考表2，根据起始样品大小决定抽提溶液体积。
4. 样品匀浆
匀浆充分与否是决定总RNA 和基因组DNA 得率的关键。
匀浆前，动物组织用液氮碾磨分散细胞，酵母菌需酶解制备成原生质体或用液氮碾磨破坏细胞壁，以提高裂解效率。动物细胞可直接进行匀浆。匀浆时用带4～6 号针头的1 ml 注射器反复快速吸注溶液，将基因组DNA 剪切成相对较小的片段，以降低溶液的粘稠性。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不连续滴状滴落，而非连续状。
5. 沉淀蛋白质与基因组DNA
在匀浆中加入Buffer R-B，促使蛋白质发生变性凝集并与基因组DNA 形成紧实的不溶性复合物。若匀浆不充分，溶液仍很粘稠，此时大部分RNA 将被不溶性复合物包裹而丢失。
6. 相分离技术分离RNA 和DNA
在Buffer R-C 驱动的相分离过程中，RNA 被分配在下相；基因组DNA-蛋白质复合物沉淀在相间。分离下相和相间沉淀分别作RNA 纯化（见操作过程7）和基因组DNA 纯化（见操作过程8）。
7. 纯化RNA
吸取下相时，偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见图1）
若起始样品是动物组织，可能有不溶性物质沉淀在管底。吸取下相时，勿吸入管底沉淀。因为在后续的相分离过程中，这些不溶性物质将和RNA 一起沉淀在管底，不能被去除干净。
在分离到的下相中加Buffer R-D 进行相分离将RNA 选择性地沉淀到管底，经50%乙醇洗涤后即可用于RT-PCR、Northern Blot、制备mRNA 和构建cDNA 文库等实验。或者用Buffer R-A 溶解RNA 沉淀，再用异丙醇沉淀，彻底去除盐份。
8. 纯化DNA
彻底去除上相和下相溶液，保留相间沉淀，加Buffer G-A 溶解沉淀释放DNA。在Buffer G-B 变性蛋白质后，加入Buffer P2 将DNA 分配到下相。吸弃上相，将下相转入Filter。吸取下相时，偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见图2）：
离心过滤，在滤液中加Buffer B 调整DNA 结合条件。将溶液转入DNA-prep Tube，离心过滤使 DNA选择性地结合到silica 膜上，经洗涤进一步去除杂质后，DNA 可被微量去离子水或Eluent 洗脱下来。
9. RNA 和DNA 保存
RNA 对理化因数非常敏感，应以乙醇盐沉淀的形式或溶于Buffer TE，置-20℃以下保存。基因组DNA置-20℃保存。
五、 注意事项
1. Buffer R-A 和BufferG-A 含有刺激性胍盐，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染到皮肤、眼睛和衣服，谨
防吸入口鼻。若沾染皮肤或眼睛，立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询或治疗。
2. 在提取总RNA 的操作过程中，要始终戴一次性乳胶手套，使用RNase-freeTip 头和微量离心管，以避免RNA
酶污染。
3. 建议设置RNA 专门工作场所，应避免在DNA 工作场所（经常使用 RNA 酶）做提取RNA 工作。
4. 建议使用RNA 专用分析仪器设备，如电泳槽、微量加样器等。
六、 实验准备
从所有样品中提取总RNA 和基因组DNA 都需做如下准备：
1. RNase-free 的Tip 头、1.5 ml 离心管、带4～6 号针头的1 ml 注射器。
2. 4℃预冷Buffer R-A、Buffer R-B、Buffer R-C 和Buffer R-D。
3. 65℃预热Buffer G-A、Eluent 或去离子水。
4. 检查Buffer R-E 是否出现沉淀，若有沉淀请于37℃温育至沉淀完全溶解。
5. 检查Buffer G-A 和BufferG-B 是否出现沉淀，若有沉淀于65℃温育直至沉淀完全溶解。溶解沉淀后不必恢复至室温，可直接用于实验。
6. 第一次使用时，在Buffer W2 中按试剂瓶上指定得体积加入无水乙醇。
7. 异丙醇。
8. 50%乙醇，4℃预冷。
9. 冰水浴和65℃水浴。
10. 将离心机预冷至4℃；纯化基因组DNA 时将离心机恢复至室温。
从各种样品中提取总RNA 和基因组DNA 需准备事项如下：
（一）从动物细胞中提取总RNA 和基因组DNA
从培养的贴壁动物细胞中提取总RNA 需配制PBS 或不含血清的培养基。室温密闭贮存，使用前4
℃预冷。
PBS：1.44 g Na2HPO4·2H2O(或1.15 g Na2HPO4), 0.2 g KH2PO4, 0.2 g KC1, 8.0 g NaCl，加水至1升，调节pH 至7.2，高压灭菌。
（二）从动物组织中提取总RNA 和基因组DNA
液氮、研钵和研棒。
（三）从酵母菌中提取总RNA 和基因组DNA
1. 用酶法需作如下准备：
（1）配制酵母菌原生质体制备缓冲液：
1 M 山梨醇, 0.1 M EDTA, pH 7.4。使用前加β-巯基乙醇至终浓度为0.1 %，按70 U / 1×107 细胞的比例加入Lyticase。
（2）30℃水浴。
2. 用研磨法需准备液氮、研钵和研棒
七、 操作步骤
以下是以1×107 动物细胞、100 mg 动物组织或5×107 酵母菌为例的总RNA 和基因组DNA 提取方法。
从其他大小的样品中提取总RNA 和基因组DNA 时，参考表2 调整抽提溶液体积。
表2：起始样品大小和相应的抽提溶液体积
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