微量DNA的纯化
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微量DNA的纯化

点击：   作者：   来源：  时间： 2007-03-06 　本站论坛
1.对于微量DNA样品溶液（如100ml以下），应预先将DNA溶液以TE或无菌水稀释至一定体积。以减少第5步中的DNA损失。 2.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇[1]（25:24:1）。 3.剧烈振荡管中内容物，将水相和有机相充分混匀，使之成为乳浊液。 4.室温下静置以初步分层。再用离心机于室温以10000rpm离心至少5分钟以上，使无机相与有机相充分分开。 5.用剪去尖头的微量移液器枪头[2]小心移出水相于一干净离心管中（不要扰动界面上的蛋白质层），弃去有机相、两相界面层及接近两相界面层的水相。 6. 重复步骤2-5直至两相界面上看不到蛋白质层。 7..加入等体积的氯仿并重复步骤2-5。 8.加入1/10体积乙酸钠（3.0mol/L，pH 5.2），再加入等体积的异丙醇，颠倒混匀。 9.用离心机于室温以10000rpm离心10分钟使核酸沉淀[3]。倾掉上清液。 10.加入1/2离心管体积的75%乙醇洗涤DNA沉淀[4]10分钟。 11.10000rpm离心2分钟。使DNA沉淀紧贴管底。 12.倾掉上清液，将离心管倒置于纸巾上使残留液体挥发至干。 13.用适当体积的TE（pH8.0）缓冲液溶解DNA沉淀，用缓冲液充分洗管壁。-20℃贮藏。 [1]任何含有苯酚或/和氯仿的试剂都应使用巴斯德吸管或玻璃滴管，切忌使用微量移液器，因苯酚和氯仿（尤其是后者）都对微量移液器具有强腐蚀性。 [2]使用剪去尖头的微量移液器枪头以避免水流搅动界面。 [3]纯化良好的DNA沉淀于离心管底，无色透明，肉眼不可见。 [4]只需浸泡静置，不用将DNA沉淀重新悬浮。

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