[实验目的]
掌握用直接测定法和比色法测定动物的血红蛋白的含量。
[实验原理]
血红蛋白的颜色常与氧的结合量多少有关。但当用一定的氧化剂将其氧化时，可使其转变为稳定、棕色的高铁血红蛋白，而且颜色与血红蛋白（或高铁血红蛋白）的浓度成正比。可与标准色进行对比，求出血红蛋白的浓度，即每升血液中含血红蛋白克数（g·L-1）。
血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合形成稳定的氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide,HiCN）。HiCN在波长540 nm和液层厚度1cm的条件下具有一定毫摩尔消光系数。可用经校准的高精度分光光度计进行直接定量测定；或用HiCN标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。
[实验对象]
动物种类不限。
[实验药品]
HiCN转化液（Van Kampen-Zijlstra液，文齐氏液※，标准商品）或1%HCl、HiCN标准液（200 g·L-1，标准商品）、蒸镏水、95%酒精、乙醚、75%酒精.
[仪器与器械]
血红蛋白计（或分光光度计）或沙里氏血红蛋白计、小试管、刺血针或注射器，微量采血管，干棉球。
[实验方法与步骤]
1.使用血红蛋白计直接定量测定
（1）XK-2血红蛋白仪板面结构如图 (6.2-1)：
（2）仪器的标定
①板面后的电源开关置于断。仪器的底部的支撑架打开。
②打开电源开关，选择键处于测试挡。
③按一下进样键，将蒸溜水吸入，预热30 min
④预热后将文齐试剂吸入，仔细调“调零旋钮”使显示屏上的数字显示为零。
⑤校正：吸入标准液(仪器配带有)后，缓缓旋转校正旋钮使显示屏上数字显示为已知的标准液的数值。定标即结束。以后调零和校正旋钮均不能动。
（3）在小试管中事先加入HiCN转化液(文齐氏液)5 ml。
（4）取血：可吸取从动物的指（尾）端流出的第二滴血，也可取静脉血和心脏血。用拇指和食指轻轻捏扁采血管的乳胶头，将采血管的一端水平接触血滴（若是抗凝血，须注意摇匀后再吸取），轻轻缓慢地松开拇指，利用虹吸现象使血液进入微量采血管至20 μl（第2个刻度）。用棉球擦去微量采血管尖端外周的血液。
（5）血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白：将微量采血管插入小试管HiCN转化液中，置血液于管底，再吸上清液2～3次，洗尽采血管内的残存的血液。用玻棒轻轻搅动管内血液，使之与HiCN转化液混匀。试管须静止5 min。
(6)将混合后的血液吸入血红蛋白仪，显示屏上的数字即为测定值，需稳定后方可读数(g·L-1)。
2.使用HiCN标准液比色法测定
（1）标准曲线绘制和K值计算：将标准HiCN液按梯度50 g·L-1、100 g·L-1、150 g·L-1、200 g·L-1进行稀释后（以此代表标准的血红蛋白浓度梯度），在波长540 nm、光径1.0cm条件下，分别测定各稀释液的吸光度(例如分别测得0.13、0.27、0.405、0.54)，以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或求出换算常数K。
（2）以上述同样的方法取血，并使血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白。然后以转化液作空白，测定标本吸光度A。
（3）通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用K值来计算血红蛋白浓度，即
Hb（g·L
-1）=K×A (6.2-2)
3.使用沙里氏血红蛋白计测定
沙里氏比色法是用HCl使血红蛋白酸化形成棕色的高铁血红蛋白，然后和标准比色板进行比色。
（1）沙里血红蛋白计 主要具有标准褐色玻璃比色箱和1只方形刻度测定管组成。比色管两侧通常有两行刻度；一侧为血红蛋白量的绝对值，以g·dl-1(每100 ml血液中所含血红蛋白的克数)表示，从2～22 g；另一侧为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，从10%～160%。为避免所使用的平均值不一致，因此一般采用绝对值来表示。
（2）具体测定方法如下：
①用滴管加5～6滴，0.1mol·L
-1 HCl到刻度管内,(约加到管下方刻度”2”或多或10%处)。
②用微量采血管吸血至20 μl(方法同上述)，仔细揩去吸管外的血液。
③将吸血管中的血液轻轻吹到比色管的底部，再吸上清液洗吸管3次。操作时勿产生气泡,以免影响比色。用细玻棒轻轻搅动，使血液与盐酸充分混合，静置10 min，使管内的盐酸和血红蛋白完全作用，形成棕色的高铁血红蛋白。
④把比色管插入标准比色箱两色柱中央的空格中。
⑤使无刻度的两面位于空格的前后方向，便于透光和比色。用滴管向比色管内逐滴加入蒸馏水，并不断搅匀，边滴，边观察、边对着自然光进行比色，直到溶液的颜色与标准比色板的颜色一致为止。
⑥读出管内液体面所在的克数，即是每100 ml血中所含的血红蛋白的克数。比色前，应将玻棒抽出来，其上面的液体应沥干净，读数应以溶液凹面最低处相一致的刻度为准。换算成每升血液中含血红蛋白克数（g·L
-1）。
[注意事项]
1.取血前要做好充分的消毒。
2.血液要准确吸取20 μl，若有气泡或血液被吸入采血管的乳胶头中都应将吸管洗涤干净，重新吸血。洗涤方法是：先用清水将血迹洗去，然后再依次吸取蒸馏水、95%酒精、乙醚洗涤采血管1～2次，使采血管内干净、干燥。作为学生练习，微量采血管可反复使用。
3.使用血红蛋白仪测定时，吸样管应插入试管底部，避免吸入气泡，否则会影响测试结果。仪器连续使用时，每隔4小时要观察一次零点，即吸入文齐试剂，用“调零旋钮”使仪器恢复到零点。仪器用完后，关机前要用清洗液清洗。否则会影响零点的调整。
[实验结果]
报告该实验动物的血红蛋白浓度。并将全班的结果加以统计,用平均值±标准差表示。
[思考题] 血红蛋白的含量与年龄的关系？
影响血红蛋白含量的主要因素？
[附]： ※1.HiCN转化液：即文齐氏液，有标准商品出售。也可配制： 高铁氰化钾(K3Fe（CN）6)200 mg，氰化钾（KCN）50 mg，无水磷酸二氢钾（KH
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