植物组织中DNA的提取与测定

一、原理

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

二、材料、仪器设备及试剂：

（一）材料：去胚乳的小麦芽，新鲜花椰菜等。
（二）仪器设备：1. UV－120分光光度计；2. 磨口三角瓶；3. 具塞刻度试管；4. 研钵等器皿。

试剂：
1. 研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。
2. 10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。
3. 1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。
4. 0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。
5. Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。
6. 氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
7. 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO₄．H₂O₇ 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。
8. SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用
9. 1mol／L HCl。

10. 0.2mol/L NaOH。
11. 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H₂O＝1：50（V／V）］。
12. 1.0mol/L 高酸溶液（HClO₄）。
13. 0./L 高氯酸溶液。
14. 0.05mol/L NaOH。
15. DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L^-1NaOH中，再用0.05mol/L NaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml 1mol/L HClO₄，混合冷却后用0.5mol/L HClO₄定容至刻度，则得100μg/ml 的标准溶液。

三、实验步骤

（一）DNA的提取与纯化：1. 称取去胚乳小麦芽10g（或其它植物幼嫩组织）剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2. 将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡0.5min，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。接着以4000rpm离心5min。3. 离心后，形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4. 将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L 高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5. 再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min后，取上清液置小烧杯中。6. 用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7. 将核酸沉淀物在烧杯内壁上轻轻挤压，以除去乙醇，先用5ml的0.1×SSC溶液溶解，然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。8. 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9. 加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。10. 加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，在室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11. 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。（若不做8～11步，得到的是粗制品）。

（二）DNA的鉴定（紫外吸收法）核酸类物质含有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基中都有共轭双键（＝C－C＝），在紫外区260nm处有最高吸收峰，230nm处有最低吸收峰，纯化的DNA在UV－120紫外分光光度计测得有A260/A280≥2即为DNA的典型吸收峰。只要将第7步提出的DNA粗制品溶解并定容至5ml，即可上机测定。